前 言
本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.2-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。
本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.2-2008相比，主要修改如下：
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；
——修改了菌落總數(shù)計(jì)算公式中的解釋；
——修改了培養(yǎng)基和試劑；
——刪除了**法 菌落總數(shù)PetrifilmTM 測(cè)試片法。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：
——GB 4789.2-1984、GB 4789.2-1994、GB/T 4789.2-2003、GB/T 4789.2-2008。
食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)（Aerobic plate count）的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。
2 術(shù)語(yǔ)和定義
2.1 菌落總數(shù) aerobic plate count
食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。
3 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)**及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒溫水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量為0.1 g。
3.5 均質(zhì)器。
3.6 振蕩器。
3.7 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
3.8 無(wú)菌錐形瓶：容量250 mL、500 mL。
3.9 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。
3.10 pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。
3.11 放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A 中A.1。
4.2 磷酸鹽緩沖液：見附錄A 中A.2。
4.3 無(wú)菌生理鹽水：見附錄A 中A.3。
5 檢驗(yàn)程序
菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。
圖1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序
圖1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序
6 操作步驟
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì)1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min，制成1:10 的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。
6.1.3 用1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL 稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。
6.1.4 按6.1.3 操作程序，制備10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1 次1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。
6.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2 個(gè)～3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，吸取1 mL 樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL 空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。
6.1.6 及時(shí)將15 mL～20 mL 冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。
6.2 培養(yǎng)
6.2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。水產(chǎn)品30 ℃±1 ℃培養(yǎng)72 h±3 h。
6.2.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1 條件進(jìn)行培養(yǎng)。
6.3 菌落計(jì)數(shù)
可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。
6.3.1 選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU 之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。
6.3.2 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。
6.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。
7 結(jié)果與報(bào)告
7.1 菌落總數(shù)的計(jì)算方法
7.1.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。
7.1.2 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：
（1）式中：
N = ΣC /(n1+0.1 n2 )d
N——樣品中菌落數(shù)；
ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；
n1——**稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；
n2——**稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；
d——稀釋因子（**稀釋度）。
示例：
稀釋度 1:100（**稀釋度） 1:1000（**稀釋度）
菌落數(shù)（CFU） 232，244 33，35
上述數(shù)據(jù)按7.2.2數(shù)字修約后，表示為25000或2.5×104。
7.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對(duì)稀釋度*高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以*高稀釋倍數(shù)計(jì)算。
7.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度*低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
7.1.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1 乘以*低稀釋倍數(shù)計(jì)算。
7.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU～300 CFU 之間，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 時(shí)，則以*接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。
7.2 菌落總數(shù)的報(bào)告
7.2.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。
7.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時(shí)，第3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)；也可用10 的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。
7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。
7.2.4 若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
7.2.5 稱重取樣以CFU/g 為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。
附錄A
（規(guī)范性附錄）
培養(yǎng)基和試劑
A.1 平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基
A.1.1 成分
胰蛋白胨 5.0 g
酵母浸膏 2.5 g
葡萄糖 1.0 g
瓊 脂 15.0 g
蒸餾水 1000 mL
pH 7.0±0.2
A.1.2 制法
將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121 ℃高壓**15 min。
A.2 磷酸鹽緩沖液
A.2.1 成分
磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g
蒸餾水 500 mL
pH 7.2
A.2.2 制法
貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)
pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓**15 min。
A.3 無(wú)菌生理鹽水
A.3.1 成分
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
A.3.2 制法
稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓**15 min。
公安機(jī)關(guān)備案號(hào)：
