一、優化抗體選擇與配對
1、?高特異性抗體
優先選擇單克隆抗體或經過驗證的多克隆抗體,確保其僅識別目標抗原的特定表位。
雙抗體夾心法中,包被抗體和標記抗體應針對抗原的不同表位,避免競爭結合。
2、?抗體稀釋液優化
使用含吐溫20的PBS緩沖液(0.05%吐溫20)作為稀釋液,可減少疏水性非特異性吸附。
添加EDTA(10mmol/L)可進一步降低金屬離子干擾。
二、封閉步驟改進
1、?封閉劑選擇
常用5%脫脂奶粉或1%BSA封閉非特異性位點,若檢測抗體與BSA存在交叉反應,可改用明膠或酪蛋白。
非蛋白類封閉劑(如PVP)適用于避免蛋白干擾的體系。
2、?封閉條件
37℃孵育1-2小時,確保孔板表面完全覆蓋。
三、樣本處理與洗滌優化
1、?樣本預處理
離心去除溶血或脂血樣本中的血紅蛋白和脂質,避免假陽性。
高濃度樣本需稀釋至線性范圍內,防止“鉤狀效應”。
2、?洗滌條件
增加洗滌次數(5-6次)并延長每次洗滌時間(30秒),徹底去除未結合抗體。
洗滌液中添加0.05%吐溫20可增強去除非特異性結合的效果。
四、實驗操作控制
1、?孵育條件
嚴格遵循推薦的溫度(通常37℃)和時間,避免過度反應導致非特異性結合。
2、?設備校準
定期校準酶標儀和移液器,確保檢測精度。
五、試劑盒設計驗證
通過交叉反應率測試(如類似物質檢測要求<5%)驗證特異性。
競爭法需陰陽性對照OD值差≥4.0,確保排除非特異性結合。
通過上述方法可顯著降低非特異性結合,提高ELISA檢測的準確性和可靠性。