一、優化抗體選擇與配對

1、?高特異性抗體

優先選擇單克隆抗體或經過驗證的多克隆抗體，確保其僅識別目標抗原的特定表位。

雙抗體夾心法中，包被抗體和標記抗體應針對抗原的不同表位，避免競爭結合。

2、?抗體稀釋液優化

使用含吐溫20的PBS緩沖液（0.05%吐溫20）作為稀釋液，可減少疏水性非特異性吸附。

添加EDTA（10mmol/L）可進一步降低金屬離子干擾。

二、封閉步驟改進

1、?封閉劑選擇

常用5%脫脂奶粉或1%BSA封閉非特異性位點，若檢測抗體與BSA存在交叉反應，可改用明膠或酪蛋白。

非蛋白類封閉劑（如PVP）適用于避免蛋白干擾的體系。

2、?封閉條件

37℃孵育1-2小時，確保孔板表面完全覆蓋。

三、樣本處理與洗滌優化

1、?樣本預處理

離心去除溶血或脂血樣本中的血紅蛋白和脂質，避免假陽性。

高濃度樣本需稀釋至線性范圍內，防止“鉤狀效應”。

2、?洗滌條件

增加洗滌次數（5-6次）并延長每次洗滌時間（30秒），徹底去除未結合抗體。

洗滌液中添加0.05%吐溫20可增強去除非特異性結合的效果。

四、實驗操作控制

1、?孵育條件

嚴格遵循推薦的溫度（通常37℃）和時間，避免過度反應導致非特異性結合。

2、?設備校準

定期校準酶標儀和移液器，確保檢測精度。

五、試劑盒設計驗證

通過交叉反應率測試（如類似物質檢測要求<5%）驗證特異性。

競爭法需陰陽性對照OD值差≥4.0，確保排除非特異性結合。

通過上述方法可顯著降低非特異性結合，提高ELISA檢測的準確性和可靠性。