原代細胞分離：

一、細胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

二、原代細胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。1懸浮細胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細胞增殖檢測技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂

的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從干擾組細胞數(shù)大于對照組的事實說明可促進細胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

其中常見檢測：CCK8檢測法 ，MTT檢測法，Brdu檢測法，Edu檢測法，平板克隆形成。

四、細胞周期檢測技術(shù)

細胞周期指由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間。

常用的方法：流式檢測細胞周期，標記有絲分裂百分率法。

五、細胞凋亡檢測

常見檢測方法：流式檢測細胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色，電鏡，TUNEL。

訂購信息：

英文簡稱：EM-3細胞

產(chǎn)品名稱：髓系白血病細胞

貨號：BJ-01X10511

規(guī)格：髓系白血病；女性

形態(tài)特性:IMDM

生長特性:懸浮

【培養(yǎng)指南】

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細胞|細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

【細胞凍存】

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行293/HEK-293細胞|細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。懸浮細胞凍存時，應(yīng)將細胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液(防止細胞吸走)，加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進行凍存。

【復(fù)蘇的原則】

快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。復(fù)旦細胞庫各地均可發(fā)貨，統(tǒng)一價格，本公司出售的所有細胞僅供科研使用。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

GABR B3/GABA A Receptor beta 3  G氨基丁酸受體3抗體規(guī)格: 0.2ml

KRIT1  腦海綿狀血管畸形蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

HPV16 L2  人瘤病毒16型L2抗體規(guī)格: 0.2ml

OLIG1  少突膠質(zhì)  轉(zhuǎn)錄因子1規(guī)格: 0.2ml

SH2B1  SH2B蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

Coronin 1a  肌動蛋白結(jié)合蛋白CORO1A抗體規(guī)格: 0.2ml

Nitrotyrosine  硝基酪氨酸抗體規(guī)格: 0.2ml

XDH/Xanthine Oxidase  黃嘌呤氧化酶抗體規(guī)格: 0.1ml

phospho-CstF64(Ser498)  磷酸化  分裂相關(guān)蛋白CSTF64抗體規(guī)格: 0.1ml

Hemoglobin Beta  血紅蛋白β抗體規(guī)格: 0.2ml

Desmuslin  中間絲蛋白β-synemin抗體規(guī)格: 0.2ml

G Protein alpha Inhibitor 1  G蛋白α抑制蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

DSPP/Dentin phosphophoryn  牙本質(zhì)磷蛋白抗體規(guī)格: 0.1ml

髓系白血病細胞1瓶 CCC-HEL-1  株 CCC-HEL-1 低溫運輸和保存

XLD培養(yǎng)基平板（9cm） Xylose Lysine Desoxycholate Medium 10個/包

膽硫乳瓊脂（DHL） Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar 250g

1瓶 VX2  株 VX2 低溫運輸和保存

250mL Phosphate Buffer，0.5M, pH7.2   Phosphate Buffer，0.5M, pH7.2   常溫保存

碳酸氫鈉瓊脂基礎(chǔ) NaHCO3 Agar Base 250g

澤瀉醇A Alisol A 19885-10-0 20mg

250mL Tricine-SDS-PAGE配膠液 Tricine-SDS-PAGE Gel Buffer  常溫保存

氯化血紅素 hemin 1g

1瓶 AsPC-1  株 AsPC-1 低溫運輸和保存

50T 豬牛絳蟲PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

100mL Kinase Buffer VI,5X  Kinase Buffer VI,5X  常溫保存

種芽孢培養(yǎng)基 Bacillus Bacteria Medium 250g

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