原代細(xì)胞分離：

一、細(xì)胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇（可參閱后面有關(guān)章節(jié)）為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、原代細(xì)胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細(xì)胞增殖檢測技術(shù)

目前主要有兩種用于檢測細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進(jìn)行分裂

的細(xì)胞數(shù)來評價細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細(xì)胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評價細(xì)胞的增殖能力。顯然，細(xì)胞活力檢測法并不能終證明檢測樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細(xì)胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量，但我們并不能從干擾組細(xì)胞數(shù)大于對照組的事實說明可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。

其中常見檢測：CCK8檢測法 ，MTT檢測法，Brdu檢測法，Edu檢測法，平板克隆形成。

四、細(xì)胞周期檢測技術(shù)

細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細(xì)胞周期時間。

常用的方法：流式檢測細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法。

五、細(xì)胞凋亡檢測

常見檢測方法：流式檢測細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色，電鏡，TUNEL。

訂購信息：

英文簡稱：BHK-21細(xì)胞

產(chǎn)品名稱：倉鼠腎成纖維細(xì)胞；BHK-21

貨號：BJ-01X8523

規(guī)格：T25

形態(tài)特性:成纖維細(xì)胞樣

生長特性:貼壁生長

特征特性:該細(xì)胞系是于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性別的1天齡倉鼠腎；可作為轉(zhuǎn)化宿主；OIE組織將該細(xì)胞用于狂犬病的診斷。

培養(yǎng)條件:DMEM(高糖）+10%FBS（gibco）

傳代方法:1：2傳代，每周換液1~2次。

【培養(yǎng)指南】

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞|細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫???，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

【細(xì)胞凍存】

待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行293/HEK-293細(xì)胞|細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。懸浮細(xì)胞凍存時，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM條件下離心4分鐘，少量保存上清液(防止細(xì)胞吸走)，加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO后進(jìn)行凍存。

【復(fù)蘇的原則】

快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。復(fù)旦細(xì)胞庫各地均可發(fā)貨，統(tǒng)一價格，本公司出售的所有細(xì)胞僅供科研使用。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

Skp2/skp2 p45    S期激酶相關(guān)蛋白2抗體規(guī)格: 0.1ml

SLC4A4  碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白4-A4抗體規(guī)格: 0.1ml

Slc4a7/Nbcn1  碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白4-A7抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC9A9  鈉氫通道蛋白9家族A9抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC39A7  轉(zhuǎn)運蛋白家族39成員7抗體規(guī)格: 0.2ml

NGALR/Slc22A17  可溶性載質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白22A17抗體規(guī)格: 0.1ml

SLC24A5  可溶性載質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白SLC24A5抗體規(guī)格: 0.1ml

SLCO2B1/OATPB  可溶性載質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白2B1抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC25A10  線粒體二羧酸載體蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC25A11  線粒體二羧酸載體蛋白11抗體規(guī)格: 0.2ml

Slc26a5  感覺神經(jīng)性耳聾常染色體隱性遺傳61抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC25A13  線粒體內(nèi)鈣結(jié)合天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

SLC37A4/G6PT2  葡萄糖-6磷酸轉(zhuǎn)運蛋白抗體規(guī)格: 0.2ml

倉鼠腎成纖維細(xì)胞；BHK-212 ug pAAV-MCS pAAV-MCS 低溫運輸，-20℃保存

尿素瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ) 用于鑒別腸道尿素酶試驗 (GB4789.4－2010，《中華人民共和國藥典》2010年版，SN0170-92和GB130... 250g

2 ug pCAMBIA2301 pCAMBIA2301 低溫運輸，-20℃保存

5g 金胺 O Auramine O 室溫干燥避光保存

葡萄糖發(fā)酵管  20支

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 用于藥品、生物制品的樣品稀釋。(CP) 250g

2 ug SD1211-chip-Ctr SD1211-chip-Ctr 低溫運輸，-20℃保存

3%氯化鈉堿性蛋白胨水 用于嗜鹽性細(xì)特別是副溶血性弧及創(chuàng)傷弧的前增培養(yǎng)。 225mlX6瓶

50T 呼吸道合胞病毒B組PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

1瓶 HCT-15  株 HCT-15 低溫運輸和保存

2 ug pGBKT7-Lam pGBKT7-Lam 低溫運輸，-20℃保存

胰蛋白胨 Tryptone 250g

30次 一站式SDS-PAGE電泳套裝 One-Stop SDS-PAGE Pack 丙烯酰胺溶液4℃保存，上樣緩沖液需要-20℃保存，其余常溫保存

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