熒光定量PCR原理等大家都已經很熟了，我就不細說了，主要是寫一些有人問過的事，希望寫的內容是大家都關心的。 

普通PCR與熒光定量PCR技術區別？ 

    簡單的講PCR技術*早是用于擴增一段特異的PCR片段，用于克隆、測序等實驗，后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或非很粗的相對定量，而熒光定量PCR技術則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對及**量，是一種測定特異的PCR片段含量的方式。如測定病人樣本中病原體的含量、實驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。 

前些年有人講過普通PCR后，通過電泳也可以進行定量，其實是將PCR產物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。近兩年沒有人再講這類的話了。 

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX這些方法如何選擇？     

從實驗成本來講，Sybr Green是*好的，基本上就是普通PCR加上一點Sybr Green I 熒光染料即可，其信號強度也很好，還可以進行融解曲線分析等，但缺點是只能在一個反應管內進行一種PCR反應的檢測，另一個問題是非特異性擴增會影響實驗結果，當然也有一些技術解決這些問題，后面會講到。對于研究人員來講，如果需要檢測的基因很多，而每個反應管中進行一種PCR反應的檢測可以滿足實驗要求，則Sybr Green是*好的選擇。 

    如果需要進行多通道實驗，即在一個反應管中進行2種或以上的反應，則要選擇其他的方法，*常用的是Taqman、Molecular beacon，這兩種都是探針的方式，由于增加了探針的特異性，因此其擴增曲線反映的就是特異性產物的擴增曲線，不含有非特異性擴增的成分。因此商業用途的檢測試劑盒大都采用這一技術，以減少非特異性產物造成錯誤結論的可能性。其缺點在于探針成本較高，有時設計的探針并不合適，有造成損失的可能性。并且要進行較多的實驗條件的優化。這兩種探針技術用于商業目的時都有**問題，據說取得Molecular beacon的許可權的成本相對較低，但只是據說。 

    另一種值得一提的是LUX探針，它也可進行多通道實驗，但它沒有Taqman和Molecular beacon方法的增加探針特異性的功能，因此只能是一種折中的方案，如果不考慮多通道實驗，則不如Sybr Green法 

選擇單通道實驗還是多通道實驗？     

這是要根據實驗需要來選擇的，如果有一個、兩個或是三個基因要進行比較，并用看家基因進行對照，可以考慮選擇多通道實驗。多通道實驗的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一是條件的優化比較麻煩，即多種PCR反應以及探針要在同一個反應條件下進行，并且效率都要比較高，另一個困難是要求相互之間沒有干擾，因為干擾會影響到實驗結果。還有一個困難是當一個基因的模板數顯著大于其他基因時，因為共用核苷酸等資源的原因，會讓模板數少的基因的定量值變小或變為零。因此一般兩通道的實驗比較多些，即一個基因進行多樣本比較，用看家基因進行對照。 

    可以看出，如果單通道實驗可以解決問題，就不要選擇多通道實驗了。三個以上的基因進行比較時就*好用單通道。因為一般的儀器*多也只有四個通道，就是有更多的通道，實驗條件的優化也是足夠麻煩了。 

雙通道實驗時如何克服反應條件、干擾以及模板數差別很大等困難？     

對于反應條件的優化，可通過兩個單獨實驗的標準曲線來優化，主要是復性溫度，可用PCR儀的溫度梯度功能來選擇，然后找到一個合適的復性溫度。對于如何確定是否存在相互干擾，則要通過兩個獨立的單通道實驗與雙通道實驗的結果進行比較，如果差別不大，則表明沒有干擾。至于模板數差別很大的問題，可以通過降低引物濃度的方法來實現，即primer limited，在一般的PCR反應中，引物的濃度是足夠高的，基本上可以將反應液中的核苷酸全部消耗盡，在優化引物濃度時，用不同的引物濃度進行實驗，找到不影響反應的C(t)值的*低引物濃度。這樣在實際反應中，模板數高的基因在引物耗盡后，反應液中仍然有足夠的核苷酸等用于另一個基因的反應。 

引物設計中的幾個注意事項 

1、 引物設計*好用相關的軟件來進行設計，考慮引物自身回折、錯配、引物二聚體、復性溫度、產物變性溫度等問題，其中產物的變性溫度是大家不太關心的問題，但有些產物在一般的95度條件下不能充分解鏈，會嚴重影響實驗結果。

2、 引物所設計的片斷一定要有足夠的特異性，選擇好片段后，*好到互聯網中進行相關的搜索，看在樣本的基因組有沒有相擬的基因以及假基因等，如果有，則可選擇特異性更高的區域。 

3、 在進行mRNA表達量的定量，可以在引物設計時考慮基因組的污染問題，即在引物設計時讓兩個引物跨一個內含子，這樣基因組污染所造成的擴增可以區別出來，或因為片段過大而不能擴增 

4、 由于mRNA表達量的定量有一個逆轉錄的過程，如果逆轉錄是用poly（T）作引物，則設計的片段盡量靠近poly（A），以免逆轉錄的效率影響到實驗結果。如果用特異性引物進行逆轉錄，則要考慮引物區是否存在RNA二級結構的問題。

5、 產物片段的大小：定量PCR一般產生片段都不大，不會超過600bp。Sybr Green法一般選擇250-600bp，過大會影響到PCR擴增的效率，過小則很難通過融解曲線與引物二聚體分開，但并不是**的。Taqman法的擴增片段都很小，幾十或是100多，這是其原理造成的。Molecular beacon法對片段大小的要求不高，只要不是太長即可。 

Sybr Green法的實驗策略： 

實驗可分為三個階段，即實驗條件的優化、預實驗和正式實驗。 

一、 實驗條件的優化階段，這一階段是*花時間的， 

1、 要找到一個陽性的模板，可以是克隆有基因質粒、強陽性樣本或純化的PCR產物等。有了陽性的模板才能進行*基本的定量擴增實驗，如果有普通PCR的實驗條件，也可以此為基礎進行實驗。 

2、 擴增出的產物要通過電泳方法確定其大小，以確認定量PCR擴增的產物是你的目的基因，有些用戶就發生過優化了幾天的條件才發現擴增片段的大小不對，不是自己想要的基因。當然，能測個序什么的*好。并通過融解曲線實驗來確定產生的Tm值以及所用的變性溫度是否已經足夠，個別情況下會出來解鍵不充分的現象。 

3、 有了基本的PCR條件后，要將陽性模板進行倍比稀釋，一般用10倍稀釋。將稀釋的模板帶上陰性對照，分成多份進行溫度梯度實驗，對復性溫度進行優化，以找出復性溫度范圍，復性溫度*好能滿足以下條件：高中低模板濃度下PCR擴增效率都很高、陰性模板沒有擴增。選擇滿足條件的中間溫度，這樣可以提高實驗的穩定性，不會因為樣本管在加熱模塊中的位置不同而影響實驗結果。 4、 如果找不到合適的條件，如引物二聚體過多，可對引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進行優化，然后再進行復性溫度梯度實驗。其中Mg2+離子濃度、DMSO含量都會影響Tm值以及所用的變性溫度。 

二、 預實驗階段 

    按照優化的條件對所需要分析的樣本做一個沒有重復的實驗，每個樣本做一個10倍和100倍稀釋的實驗，預實驗的目的主要有兩個，一是了解樣本的模板濃度范圍，如果有樣本的模板濃度在標準曲線之外，如過高或過低，則可能要對標準曲線進行重新優化，當然，如果過高和過低不影響你的實驗結論則可定為高于多少或低于多少，直接進行外推是不科學的。另一個目的看樣本中是否有PCR抑制物的影響，如果每個樣本的定量結??與其10及100倍稀釋后的樣本的結果相同，則表明沒有抑制物的影響，如果不同，如原倍結果為零，而10及100倍稀釋后的樣本的結果為陽性，則表明樣本中PCR抑制物濃度較高。可用其10及100倍稀釋后的樣本進行定量。 

有幾個用戶發現過實驗為陰性的樣本在其10及100倍稀釋后的樣本為陽性的，也許有更多用戶沒有進行這樣的實驗，得到了錯誤的結論。因為樣本RNA的提取試劑中經常有抑制PCR反應的物質，清洗不干凈就會影響到定量PCR反應。 

三、 正式實驗階段 

    然后就可以進行正式實驗了，只需要將每個樣本作三個或更多的重復即可以了。有抑制物的樣本先進行稀釋，計算濃度時不要忘記就行了。*后就可以進行實驗結果分析了，個別樣本中離群的數值可以刪除。 

Sybr Green法的注意事項 

1、 *好按照上面提到策略進行實驗，以免造成不必要重復實驗，從而降低實驗成本 

2、 Sybr Green I一般是先將母液用DMSO進行稀釋100倍，*終的使用濃度為4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀釋倍數不同，可通過實驗來證明，但高濃度的Sybr Green I肯定會影響PCR反應。另外用水稀釋后的Sybr Green I保存的時間很短，一般1周后就不能用了。DMSO似乎反復凍融會影響性能，但原因不明。 

3、 在對引物濃度、Mg2+離子濃度、DMSO含量等進行優化后仍得不到滿意的結果，特別是引物二聚體很多時，可以考慮更換引物，因為引物成本低，而優化實驗成本很高。 

4、 當有少量引物二聚體影響熒光結果時，可以提高熒光讀板時的溫度來消除引物二聚體的影響，如將讀板時的溫度提高到82度，此時引物二聚體已經解鏈而產物沒有解鏈。但引物二聚體濃度很高時會嚴重影響PCR反應，消除引物二聚體的影響也沒有用。 

5、 大家都知道進行**定量需要標準曲線，有些用戶認為進行相對定量時就不需要標準曲線了，可以通過2ΔΔC（t）來計算，但這一計算是有條件的，即所有熒光定量PCR擴增的效率都接近于100%，可以通過實驗來證明。但大多數用戶并沒有進行這樣的實驗就直接用2ΔΔC（t）來計算了。這是錯誤的，會得到錯誤結論。 

6、 無論是使用自配的試劑還是用商業的熒光定量試劑盒，*好買夠試劑，以免進行預實驗或正式實驗時沒有試劑而必需采用其他試劑，由于不同試劑的緩沖液成份有較大差別，如有的試劑中含有DMSO及Mg2+離子等，可能會影響到實驗結果，甚至要重新進行實驗條件的優化。 

7、 不要在管蓋上寫字，原因很明顯，但有些用戶習慣了寫字，后來再擦掉，也會對實驗有些影響。 

8、 *好使用高質量的PCR管，低質量管的管間差可能會很大。 

9、 每次實驗一定要有陽性對照和陰性對照，以免出現問題時找不到原因。 

10、 在樣本很珍貴時可以采用對樣本進行稀釋的方式進行定量。只要濃度不是太低，理論來講對稀釋是不會影響實驗結果的。 

    其他方法也可以采用類擬的策略，以節約成本，提高效率。

*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*熒光定量PCR實驗中的策略及注意事項*