ELISA(酶聯**吸附試驗)是一種廣泛應用于生物學和醫學領域的檢測技術,其操作流程、洗滌步驟和注意事項對實驗結果的準確性至關重要。以下將為您詳細介紹ELISA試劑盒的操作、洗滌及注意事項。
一、操作核心步驟
1、樣本處理
血清/血漿需離心分離(1000×g,10分鐘),避免溶血和**污染。
樣本4℃保存不超過1周,長期保存需-20℃分裝,避免反復凍融。
2、加樣規范
使用校準過的加樣器,加樣時間控制在5分鐘內,避免氣泡和孔壁殘留。
從低濃度到高濃度加樣,減少交叉污染;每孔加樣后輕晃混勻。
3、溫育與顯色
37℃溫育時需平衡板和溶液溫度,避免邊緣效應(外周孔顯色深于中心孔)???
底物顯色后15分鐘內用酶標儀在450nm波長讀數,終止反應后藍色立即轉為黃色。
二、洗滌方法
洗滌是ELISA實驗中的關鍵步驟,其目的是**未結合的分子,減少背景信號,提高檢測的特異性。主要有兩種方法:
1、浸泡式?:這是*常用的方法。具體步驟包括:吸干或甩干孔內液體 → 用洗滌液注滿板孔后立即甩去 → 再次注滿洗滌液,靜置1-2分鐘 → 徹底吸干孔內液體 → 重復洗滌3-4次。
2、流水沖洗式?:適用于小珠載體,也可用于微量滴定板。通過水流沖擊板孔表面進行淋洗,洗滌效果更徹底。
洗滌時需注意:
洗滌液應現配現用,避免污染。
每次洗滌都要確保孔內液體被完全去除,但避免過度拍干導致已結合的分子脫落。
洗滌次數和浸泡時間需根據實驗手冊優化,通常為3-4次。
三、實驗全程注意事項
1、試劑管理:不同批號試劑不混用,洗液需專用且新鮮配制,底物B需避光保存。
2、環境控制:實驗時保持安靜,避免唾液污染;多塊酶標板不堆疊,防止溫度不均。
3、儀器校準:定期檢查洗板機注液量,酶標儀使用前預熱并校準波長。
四、常見問題與解決
實驗過程中可能會遇到一些問題,以下是一些常見情況及解決方法:
?標準品顯色無梯度?:可能因溫度過低、試劑回溫不充分、移液器未校準或洗滌不當導致。
?陰性樣本顯色異常?:若顯色過淺,可能是試劑活性降低、溫育時間不足或加樣量不足;若顯色過強,可能是樣本被污染或顯色液被污染。
?同一樣品檢測值差異大?:需檢查前處理過程是否污染或操作失誤。