ELISA（酶聯**吸附試驗）是一種廣泛應用于生物學和醫學領域的檢測技術，其操作流程、洗滌步驟和注意事項對實驗結果的準確性至關重要。以下將為您詳細介紹ELISA試劑盒的操作、洗滌及注意事項。

一、操作核心步驟

1、樣本處理

血清/血漿需離心分離（1000×g，10分鐘），避免溶血和**污染。

樣本4℃保存不超過1周，長期保存需-20℃分裝，避免反復凍融。

2、加樣規范

使用校準過的加樣器，加樣時間控制在5分鐘內，避免氣泡和孔壁殘留。

從低濃度到高濃度加樣，減少交叉污染；每孔加樣后輕晃混勻。

3、溫育與顯色

37℃溫育時需平衡板和溶液溫度，避免邊緣效應（外周孔顯色深于中心孔）???

底物顯色后15分鐘內用酶標儀在450nm波長讀數，終止反應后藍色立即轉為黃色。

二、洗滌方法

洗滌是ELISA實驗中的關鍵步驟，其目的是**未結合的分子，減少背景信號，提高檢測的特異性。主要有兩種方法：

1、浸泡式?：這是*常用的方法。具體步驟包括：吸干或甩干孔內液體 → 用洗滌液注滿板孔后立即甩去 → 再次注滿洗滌液，靜置1-2分鐘 → 徹底吸干孔內液體 → 重復洗滌3-4次。

2、流水沖洗式?：適用于小珠載體，也可用于微量滴定板。通過水流沖擊板孔表面進行淋洗，洗滌效果更徹底。

洗滌時需注意：

洗滌液應現配現用，避免污染。

每次洗滌都要確保孔內液體被完全去除，但避免過度拍干導致已結合的分子脫落。

洗滌次數和浸泡時間需根據實驗手冊優化，通常為3-4次。

三、實驗全程注意事項

1、試劑管理：不同批號試劑不混用，洗液需專用且新鮮配制，底物B需避光保存。

2、環境控制：實驗時保持安靜，避免唾液污染；多塊酶標板不堆疊，防止溫度不均。

3、儀器校準：定期檢查洗板機注液量，酶標儀使用前預熱并校準波長。

四、常見問題與解決

實驗過程中可能會遇到一些問題，以下是一些常見情況及解決方法：

?標準品顯色無梯度?：可能因溫度過低、試劑回溫不充分、移液器未校準或洗滌不當導致。

?陰性樣本顯色異常?：若顯色過淺，可能是試劑活性降低、溫育時間不足或加樣量不足；若顯色過強，可能是樣本被污染或顯色液被污染。

?同一樣品檢測值差異大?：需檢查前處理過程是否污染或操作失誤。