ELISA實驗中信號過載(如OD值過高或標準曲線爆表)可能由以下因素引起,需結合實驗操作和樣本特性綜合分析:
一、影響因素分析:
1、樣本濃度因素
樣本濃度過高:若待測物質濃度過高,超過試劑盒的檢測上限,會導致OD值超出線性范圍,出現信號過載。
稀釋不當:稀釋倍數不準確或未按要求稀釋,可能導致樣本中目標物質濃度仍過高。
2、干擾物質影響
內源性干擾:如類風濕因子(RF)、補體、異嗜性抗體等,可能與抗體非特異性結合,增強信號。
外源性干擾:如溶血、xijun污染、高脂血等,可能產生非特異性顯色,導致信號增強。
3、試劑污染或失效?
底物溶液受污染(如變黃)或HRP酶失活會異常增強信號,需檢查試劑狀態并更換新批次。
4、溫度波動?
孵育溫度過高(如超過37℃)會加速酶促反應,建議使用恒溫箱(37±0.5℃)并避免疊放微孔板。
5、?洗滌不充分?
未徹底洗去未結合酶標記物會導致背景信號疊加,需增加洗滌次數(3-5次)并確保每孔液體倒凈。?
6、溶血或脂血樣本?
溶血樣本中的血紅蛋白含過氧化物酶活性,可能催化底物非特異性顯色,建議離心后取上清或過濾處理。
7、標準曲線異常?
標準品溶解不完全或梯度稀釋錯誤會導致曲線擬合失真,需離心混勻并驗證線性(R2>0.99)。
8、溫育條件不當:
溫育時間或溫度不適當,可能加速反應速度,導致信號過載。
二、解決方案建議:
1、樣本處理:確保樣本按要求稀釋,并避免溶血、高脂血等干擾因素。
2、試劑選擇:使用高質量試劑,并確保稀釋液適合樣本類型。
3、操作規范:嚴格按操作流程執行,注意加樣、溫育、洗板等關鍵步驟。
4、復孔差異大?:校準移液器,使用多道加液器同步操作,避免操作時差。
?為了避免信號過載,應確保樣本稀釋適當,使用正確的酶聯物濃度,控制顯色時間,進行充分的洗滌,并遵循試劑盒說明書的指導。如果遇到信號過載,可以考慮通過進一步稀釋樣本、減少酶聯物用量或縮短顯色時間來解決問題。?