ELISA試劑盒的特異性主要受以下因素影響,這些因素可能導致交叉反應或非特異性結合,從而影響檢測結果的準確性:
1.?抗原特性?
?重組抗原的純度?:基因重組抗原若未充分純化,可能殘留雜質蛋白,引發假陽性。
?自然抗原的復雜性?:病毒裂解抗原可能包含非目標蛋白,降低特異性。
2.?封閉步驟不充分?
封閉不徹底會導致微孔板表面殘留位點吸附樣本中的雜蛋白(如類風濕因子),增加背景信號和假陽性風險。優化封閉液(如BSA、酪蛋白)和孵育條件可改善此問題。
3.?樣本干擾因素?
?內源性物質?:類風濕因子(RF)、補體等可與抗體非特異性結合,導致假陽性。使用F(ab')?片段抗體或預先吸附樣本可減少干擾。
?溶血或污染?:溶血樣本中的血紅蛋白或xijun內源性酶(如HRP)可能催化底物顯色,產生假陽性。
4.?抗體質量與選擇?
?多克隆抗體的交叉反應?:多克隆抗體可能識別抗原的多個表位,易與結構相似的分子發生交叉反應。而高親和力的單克隆抗體可顯著提高特異性。
?抗體配對不當?:雙抗體夾心ELISA中,若包被抗體和標記抗體針對同一表位,可能因“鉤狀效應”導致假陰性。
5.?操作與試劑問題?
?洗滌不徹底?:殘留的未結合抗體或酶標記物會增加背景信號。
?試劑保存不當?:抗體或酶結合物失活可能導致特異性下降。
?溫度與時間控制?:孵育溫度過高或時間過長可能引發非特異性結合。
6.?試劑盒設計驗證?
高質量試劑盒會通過交叉反應率測試(如<10%)驗證特異性。例如,檢測類似物(如IGF-1、FGF1)的交叉反應率可評估試劑盒的專一性。
提升ELISA特異性的關鍵措施包括:選擇高特異性單克隆抗體、優化封閉和洗滌步驟、嚴格樣本預處理(如離心去除雜質),以及使用經過交叉反應驗證的試劑盒。?