摘 要：糞大腸菌群是水體糞便污染的指示菌。詳細介紹了多管發酵法、濾膜法、紙片法、酶底物法及分子生物學
方法檢測糞大腸菌群的優缺點及主要應用實例。
關鍵詞：糞大腸菌群;多管發酵法;濾膜法;紙片法;酶底物法
糞大腸菌群檢測方法研究進展
糞大腸菌群是一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，是當前國內、外環境監測部門評價水體污染程度的公認指標和主要監測項目之一，具有廣泛的衛生學意義。**、快速、可靠的糞大腸菌群檢測方法對于準確及時地監測水域糞大腸菌群的污染狀況，有效預報和控制流行**的發生與傳播有重要意義。
1 糞大腸菌群的檢測方法
1.1 多管發酵法
1.1.1 原理
利用大腸菌群繁殖時使乳糖發酵，并能使乳糖蛋白胨培養液變黃，同時產生氣泡。
1.1.2 檢測方法
1.1.2.1
水樣接種量將水樣充分混勻后，根據水樣污染的程度確定水樣接種量。每個樣品至少用3個不同的水樣量接種。同一接種水樣量要有5管。相對未受污染的水樣接種量為10、1、0.1mL;受污染水樣接種量根據污染程度接種1、0.1、0.01mL或0.1、0.01、0.001mL等。如接種體積為10mL，則試管內應裝有3倍濃度乳糖蛋白胨培養液5mL;如接種量為1mL或少于1mL，則可接種于普通濃度的乳糖蛋白胨培養液10mL中。
1.1.2.2
初發酵實驗將水樣分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養液的發酵管中，在37±0.5℃下培養24±2h。產酸和產氣的發酵管表明試驗陽性。如在倒管內產氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。
1.1.2.3
復發酵實驗輕微振蕩初發酵試驗陽性結果的發酵管，用3mm接種環或**棒將培養物轉接到EC培養液中。在44.5±0.5℃水浴下培養24±2h。培養后立即觀察，若發酵管產氣，則表明確信試驗陽性。
1.1.2.4 計算和報告結果
根據不同接種量的發酵管所表現陽性結果的數目，從MPN表中查得相應的MPN 指數，計算每升水中糞大腸菌群數的*近似值(Most probablenumber，MPN)。
1.2 濾膜法[1](Membrane tilter，MF)
1.2.1 原理
將水樣注入已**的放有濾膜(孔徑為0.45μm)的濾器中，經過抽濾，**即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養基上，44.5℃溫度下進行培養。
1.2.2 檢測方法
1.2.2.1 水樣抽濾
于濾器內先加入約10mL已**的去離子水，然后再用已**吸量管吸取一定量的充分混勻的待檢水樣，加入濾器中。在負壓50kPa下進行抽濾，快濾完前加入**水少許以沖洗濾器內壁，使水樣內的**全部集中于濾膜上。
1.2.2.2 **培養
用**鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在M-FC培養基上，濾膜截留**面向上，濾膜與培養基完全緊貼不能有氣泡，然后將平板倒置，置于44.5±0.5℃的恒溫培養箱或恒溫水浴中，培養24±2h。
1.2.2.3 計數和報告結果
糞大腸菌群菌落在M-FC培養基上呈藍色或藍綠色，其它非糞大腸菌群菌落呈灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養基上很少見到非糞大腸菌菌落。必要時可將可疑菌落接種于EC培養液，44.5±0.5℃培養24±2h，如產氣則證實為糞大腸菌群。計數呈藍或藍綠色的菌落，計算出每1L水樣中的糞大腸菌群數。
1.3 紙片法(Paper strip method)
1.3.1 原理
紙片法是以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過糞大腸菌群在上面的生長、顯色來測定的方法，即糞大腸菌在紙片培養基上呈紅色菌落，菌落周圍產生黃圈是糞大腸菌分解乳糖產酸使指示劑變色的結果。
1.3.2 檢測方法
(1)將適量待測液加到紙片上后于45℃培養18～24h。
(2)觀察結果，根據陽性紙片張數，查MPN 值表，報出結果。
1.4 酶底物法(EST)
1.4.1 原理
酶底物法是利用大腸菌群**能產生β-半乳糖苷酶(β-D-Galaetosidase)分解PG(Orthonitropheny1-β-D-Galactopyranoside)使培養液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產生葡萄糖醛酸酶(13-Glueuronidase)分解MUG(4-methY1-umbelllfery-β-DGlucuronide)使培養液在波長366nm紫外光下產生熒光的原理，來定量分析水樣中糞大腸菌群數。
1.4.2 檢測方法
酶底物法采用51孔或97孔定量盤法。檢測所需水樣為100mL。
(1)用100mL無菌稀釋瓶量取100mL水樣，加入(2.7±0.5)g MMO-MUG 培養基粉末，混搖均勻使之完全溶解，將水樣全部倒入5l孔或97孔無菌定量盤內，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內氣泡，然后用封口機封口。放入44℃培養箱中培養24h。
(2)培養后進行結果判讀。如果孔穴內的水樣變成黃色則表示該孔穴中含有大腸菌群。將定量盤在暗處用波長為366nm的紫外光燈照射，有黃色反應的孔穴如果有藍色的熒光產生則表示該定量盤孔穴中含有大腸埃希氏菌。計算有黃色反應及有熒光的孔穴數，對照MPN 表查出其代表的糞大腸菌群*可能數。
1.5 聚合酶鏈式技術(Polymerase chain reaction，
PCR)
1.5.1 原理
利用PCR技術擴增編碼約260bp的LacZ基因(β-半乳糖苷酶基因)和約150bp的Udi A 基因(β-D-半乳糖苷酶基因)的DN***段，可以分別檢
測大腸菌群數和大腸桿菌。
1.5.2 檢測方法
(1)用適當方法提取糞大腸菌群混懸液和待測水樣的DNA，提取的DN**段用紫外分光光度法測定純度和濃度。PCR擴增反應，包括變性、退火和延伸的多次循環，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
(2)將糞大腸菌群混懸液和待測水樣的PCR擴
增產物進行比較，根據DNA分子量推算，確定水樣中糞大腸菌群數。
1.6 熒光原位雜交技術(Fluorescent in situ hybridization，FISH)
1.6.1 原理
熒光原位雜交技術是根據糞大腸菌群特異的DNA序列，以利用熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與待測水樣中DNA分子雜交，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量分析。
1.6.2 檢測方法
(1)選擇專門針對糞大腸菌群的熒光標記探針序列，利用寡核苷酸探針與靶細胞專一性結合進行生物分析。基本實驗步驟為細胞固定、雜交、洗脫。
(2)雜交細胞通常用熒光顯微鏡檢測，利用流式細胞儀對每一個靶細胞的探針雜交物的熒光強度進行定量測定，然后確定菌群數。
2 各種檢測方法的比較
多管發酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，這2種方法檢測時間相對較長(48～72h)，需確認試驗，試驗步驟較為繁瑣，干擾因素多，不適于大量樣品的分析，也不能對水的衛生學狀況做出快速評價。但標準方法具有費用較低、原理簡單、利于推廣的優點，此仍是常規監測中的主要檢測方法。紙片法和酶底物法，只需18～24h培養即可報告結果，操作簡便，結果可靠，不需要確認試驗，酶底物法還可同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況。紙片法是中國環境監測總站推薦的試用方法，酶底物法已經被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，適宜污染事故應急監測。PCR技術用于大腸菌群的檢測仍然處于研究階段，還有許多技術上的限制需要突破，技術復雜，檢測費用較高，假陰性和假陽性的比例較高，缺乏精度，還有待于進一步改進，目前還不能廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。FISH 技術是細胞水平上的一
種高度專一性檢測方法。它可以在8h內給出定量檢測結果，有極低的假陽性和假陰性的比例。但其操作步驟較煩瑣，技術復雜，目前僅可以對水樣中低濃度菌群進行計數，不利于大規模推廣，因此FISH技術沒有廣泛用于糞大腸菌群的常規監測。
3 各種檢測方法的應用
多管發酵法和濾膜法是糞大腸菌群標準檢測方法，是常規監測中的主要檢測方法，本文主要介紹其它幾種方法的應用。
3.1 紙片法
紙片法是中國環境監測總站推薦的試用方法，適宜污染事故應急監測，在食品行業和食具**效果中廣泛應用。頓玉慧[2]使用3MPetrifilm腸桿菌科檢測紙片計數溫州七里港口水域中的腸桿菌科，并同SN 方法進行檢測比對，結果證明使用3MPetrifilm 檢測片來檢測水域中的腸桿菌科是可行的，2種方法檢測的結果差異不顯著。趙凌宇[3]采集蘇州具有代表性的地表水水體22個點位的樣品，進行糞大腸菌群的測定方法比較，認為紙片法適于測定受糞便污染程度較輕的湖泊水體。但是，該方法的培養時間對
陽性管率有明顯影響，認為16～18h是比較理想的培養時間。趙春霞[4]用多管發酵法與快速紙片法進行標準菌株和環境水樣的對比，認為紙片法操作和結果判斷均較容易，精密度判斷值R=0.219 5，在受控范圍內，與多管發酵法的相關性也很好(r=
0.93)。林彩華[5]將3M Petrifilm 法應用于出口水產品的檢測，認為3MPetrifilm法檢測大腸菌群的靈敏度不夠，無法檢測每克樣品含菌量10個以下。孔梅[6]利用紙片法對食具**效果進行檢測，對出現可疑結果的紙片放入乳糖膽鹽培養液中再按常規發酵法的程序進行大腸菌群檢測，可提高紙片法的靈敏度，增加與常規發酵法的陽性符合率。2008年綠洲生化致病菌測試片系列產品在北京奧運會食品**保障和抗震救災中，成為衛生部指定采購產品;2009年病原微生物測試片項目被列入科技部科技型中小企業技術**基金項目;2010年上海世博會和廣州亞運會中，微生物快速檢驗產品進一步得到成功應用。
3.2 酶底物法
酶底物法已經被世界各國國家及地方實驗室和世界各組織機構認可，能夠較**地判斷水樣的微生物污染狀況，廣泛用于糞大腸菌群的日常檢測。孫宗科[7]應用加標試驗和實際水樣檢測的方式比較酶底物法與多管發酵法用于水中大腸菌群的檢測方法的優劣和結果的一致性，得出檢測結果具有一致性(P=010 59)，假陽性率無統計學意義的差別(P
=1.000)，可以用作評價水質微生物污染的標準方法。趙春霞[4]用標準菌株和環境水樣進行對比，酶底物法精密度判斷值R=0.132 4，在受控范圍內，與多管發酵法也具有良好的相關性(r=0.89)。鄭晶[8]用酶底物法檢測蔬菜中大腸菌群，與SN方法測試結果較為接近，無明顯的差異。孫錫娟[9]用酶底物快速檢測法檢測糞源性污染的蔬菜樣品，結果表明該法敏感性及準確性與多管發酵法相一致。2008年科立得協助北京自來水公司、北京環境監測站、中國**預防控制中心、北京**預防控制中心、天津**預防控制中心等完成奧運**供水工作;美國愛德士(IDEXX)公司科立得試劑在地震災區等條件惡劣地區仍能**準確檢測居民用水。
3.3 其它方法
Bej等[10]將多重PCR用于檢測與總大腸菌群相關的基因序列，這些序列與腸道病原菌包括(E.coli，Salmoneiia spp.和Shigella app.)有關。Juck等[11]利用嵌套式PCR方法，并改進了Bej等提出的過濾方法，快速檢測水樣中低濃度的E.coli。明鎮寰[12]對聚合酶鏈式反應(PCR)快速檢測水體指示菌———大腸菌群和大腸桿菌進行了研究。采用的2對引物分別擴增了Lac Z基因的約260bp和Udi A基因的約150bp DN**段。引物Ⅰ和引物Ⅱ*低能分別擴增10-6μg或10-8μg基因組DNA。整個檢測工作在采集水樣后5～6h內完成。與常規水質檢測法相比，PCR法具有快速、準確的特點，是有效監測環境水體指示菌的一種潛在的新方法。Regnault等[13]利用Colinsitu探針檢測了尿、水(河水和生活污水)以及食品中的E.coli和E.fergusonii。該探針對所研究的不同環境介質中的E.coli具有很好的專一性，已經成功地應用于飲用水樣品中E.coli的檢測。FISH 方法的優點是不可培養的大腸菌群也可以被檢測出，其缺點是死細胞也可能被計數。因此，利用FISH 方法對**計數后，尚需對**的生理狀態進行進一步研究。黃小平[14]應用顯色熒光方法檢測牛奶或水中大腸菌群和大腸桿菌，該方法不需驗證步驟，研究過程中沒有發現假陽性和假陰性現象出現，靈敏度可達到1～5/100mL。涂楚國[15] 研究出Lactose-__<___o___Tryptone-SodiumDodecyl sulfate-Trace Elements(LTSE)培養基，采用幾種鑒定驗證試驗的LTSE法，用來快速檢測水質、食品、冷飲、餐具等各類樣品703件，結果與國標法(GB)對照總符合率為99.3%;同時與美國《水和廢水標準檢驗法》(16版1985年)中檢測糞大腸菌群的正式A-1法相比較特異性強，靈敏度高，能提高檢出率，并節約經費。張江龍[16]利用法國COLILERTR3000大腸桿菌在線自動監測儀，檢測到1個或更多大腸桿菌/100mL水的時間不足18h，對于大腸桿菌污染較嚴重的水體來說，數小時之內就能檢測出來，較傳統的實驗室方法，大大縮短了測量時間，而且可以對水體中微生物的性質進行長期不間???的采樣分析;由于COLILERTR試劑對大腸桿菌有非常高的選擇性(這點已被世界上許多國家的研究機構所證實和認可，并通過了美國USEPA 證實且被收錄到美國標準分析方法)，該儀器的分析結果可信度極高。另外一種相對較快的大腸桿菌檢測設備是**醫學科學院研制的水質**檢驗箱，其基本原理是使用濾漠-營養墊法，所用的培養基是新研制的改良遠藤培養基，比普通的遠藤培養基能獲得更加滿意的檢驗結果，尤其是對水中損傷大腸菌的檢驗有較好的效果，6～15h后可得到糞大腸菌群數的監測結果;價格也不貴。適用于各級衛生防疫部門，水廠及飲水衛生檢驗單位、野外工作單位等在實驗室或野外條件下進行水中**總數和大腸菌群的檢驗。
4 結 語
目前，大腸菌群檢測方法發展很快，已提高到分子生物學水平，使檢測更快速、準確。新檢測技術的應用普及，不僅與操作技術的簡易程度和**度有關，也與檢測設備和試劑的費用高低、對環境的影響等有關。因此要實現實際操作應用與普及還需要經歷一個長期的反復驗證完善過程，需要不斷改進操作細節，使新技術的**度得到認可。紙片法和酶底物法以其操作簡便、檢測周期短，將取代多管發酵法、濾膜法等傳統方法，尤其是酶底物法采用密封培養技術，在檢測醫院污水時可以減少人員接觸而降低檢測人員的致病風險，因此具有更強的實用價值和應用價值，極有可能在近期成為評價水質微生物污染的快速標準檢測方法之一。自動化檢測方法亦將是監測工作的發展方向，在新技術支持下，**、快速、可靠、環保、低廉的自動檢測儀器也將會被研發并得到應用與普及。
公安機關備案號：
