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雙脫氧氣鏈終止法標定DNA序列操作
日期：2025-11-30 02:39
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摘要：
雙脫氧氣鏈終止法標定DNA序列操作
DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3’-OH末端向上行的。因為2’，3’-雙脫氧氣三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脫氧氣而錯過游離-OH，當它參入到DNA鏈后，3’-OH末端消逝，使DNA鏈的延伸終止真空干燥箱。
本實驗依據此原理，將待測DNA斷片**去單鏈噬菌體M13載體，并用合成的寡聚核苷酸引物與該載體上**去待測斷片的上游順著次序退火，隨即在T7DNA聚合酶催化下施行延伸反響。實際操作中同時施行，作別終止于A、G、C和T的4個反響整體體系。每個反響整體體系均含4種脫氧氣三磷酸核苷酸(dNTP)底物，那里面—種dATP為32P標記物，以便能用放射自顯影法讀序。但在這4個反響整體體系中，作別加一種低液體濃度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，這么ddNTP可隨機參入正在延伸的DNA鏈上，使鏈延伸終止。例如在“A”管中加ddATP，反響終了時，管內全部新合成的DNA鏈都是以A結末的不一樣長度的斷片，并且這些個斷片都帶放射性。將反響物加在高辯白凝膠上電泳，DNA斷片則因其長度不一樣(分子量體積不一樣)被離合電熱恒溫鼓風干燥箱，短的走在前端，長的泳動在后面。其它3管則作別為以G，C或T結末的不一樣長度DNA斷片。
因為：①縱然是參差相差一個核苷酸的DNA斷片，亦可依據其電泳距離的差別而加以區別；②A、G、C和T4種反響整體體系的產物在電泳凝膠中相鄰排列。因而在閱覽凝膠電泳的放射自顯影圖像時，由下至上按前后順著次序即可將DNA的核苷酸順著次序讀出。