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技術(shù)文章

含量測定方法的評價

任何一種含量測定方法的評價，根據(jù)其使用的對象和要求，都應(yīng)有相應(yīng)的效能指標(biāo)。一般常用的分析效能評價指標(biāo)包括：精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、定量限、選擇性、線性與范圍、重現(xiàn)性、耐用性等；測定方法的效能指標(biāo)可以作為對分析測定方法的評價尺度也可以作為建立新的測定方法的實驗研究依據(jù)。

a、精密度(precision)
系指用該法測定同一勻質(zhì)樣品的一組測量值彼此符合的程度。它們越接近就越精密。在**分析中，常用標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(standard deviation，SD或S)；相對標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(relative standard
deviation，RSD)，也稱變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)，表示。
生物樣品分析時，常用RSD表示精密度，并可細分為批內(nèi)(或日內(nèi))精密度及批間(或日間)精密度。
批內(nèi)精密度(within-run precision)：是同一次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品各7-10份，每種濃度的樣品按所擬定的分析方法操作，一次開機后，一一測定。計算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批內(nèi)精密度也可視為日內(nèi)精密度(with- in-day precision)。所得RSD應(yīng)爭取達到5％以內(nèi)，但不能超過10%。
批間精密度(between-run precision)：是不同次測定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品，每種濃度配制7-10份，置冰箱冷凍。自配制樣品之日開始，按所擬定的分析方法操作，每天取出一份測定，計算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批間精密度也可視為日間精密度(day to day precision)。所得RSD應(yīng)控制在15％以內(nèi)。
b 、準(zhǔn)確度(accuracy)
是指測得結(jié)果與真實值接近的程度，表示分析方法測量的正確性。
由于“真實值”無法準(zhǔn)確知道，因此，通常采用回收率試驗來表示。生物**分析中，常用標(biāo)準(zhǔn)添加法來計算回收率，即取已準(zhǔn)確測定**含量P (present)的真實樣品(如人血漿樣品等)，再加入**標(biāo)準(zhǔn)品已知量A (added)，混合物作為測定液，其測定值為M (measured)。測定液要配制成高、中、低三種濃度，每個濃度測定3-5次，求出每種濃度的平均測定值M，且RSD應(yīng)符合要求。由于預(yù)先要準(zhǔn)確測定樣品中原含有的**量P，因此也應(yīng)測定3-5次，求其平均值P，且RSD應(yīng)符合要求。
回收率＝（測定液平均測定值M - 原樣品液含量平均值P）/ 加入量A×100％
回收率結(jié)果越接近100％表明分析方法準(zhǔn)確度越高。生物樣品分析時，一般控制回收率范圍應(yīng)為85％-115％(樣品藥濃＞200ug／L)及80%-120％(樣品藥濃＜200ug／L)。
制劑的含量測定時，采用在空白輔料中加入原料藥對照品的方法作回收試驗及計算RSD，還應(yīng)作單獨輔料的空白測定。每份均應(yīng)自配制模擬制劑開始，要求至少測定高、中、低三個濃度，每個濃度測定三次，共提供9個數(shù)據(jù)進行評價。
回收率＝（平均測定值M -空白值B）/ 加入量A×100％
回收率的RSD一般應(yīng)為2％以內(nèi)。
c．檢測限(limit of detection，LOD)
是指分析方法能夠從背景信號中區(qū)分出**時，所需樣品中**的*低濃度，無需定量測定。
LOD是一種限度檢驗效能指標(biāo)，它既反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低。要根據(jù)采用的方法來確定檢測限。當(dāng)用儀器分析方法時，可用已知濃度的樣品與空白試驗對照，記錄測得的被測**信號強度S與噪音(或背景信號)強度N，以能達到S／N＝2或S／N＝3時的樣品*低藥濃為LOD；也可通過多次空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差(即3δ空或3S空)作為檢測限的估計值。為使計算得到的LOD值與實際測得的LOD值一致，可應(yīng)用校正系數(shù)(f)來校正，然后依之制備相應(yīng)檢測限濃度的樣品，反復(fù)測試來確定LOD。如用非儀器分析方法時，即通過已知濃度的樣品分析來確定可檢出的*低水平作為檢測限。
d．定量限 (limit of quantitation，LOQ)
是指在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密度)的前提下，分析方法能夠測定出的樣品中**的*低濃度。
它反映了分析方法測定低**濃度樣品時具有的可靠性。它與上述的檢測限的差別在于：定量限要定量測定某一**在樣品介質(zhì)中的*低濃度，且定量限規(guī)定的*低濃度應(yīng)該符合一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。確定定量限的方法也因所用方法不同而異。當(dāng)用非儀器分析方法時，與上述檢測限的確定方法相同；如用儀器分析方法時，則往往將多次空白試驗測得的背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(即空白標(biāo)準(zhǔn)差)乘以10，作為定量限的估計值，繼之，再通過分析適當(dāng)數(shù)量已知接近定量限或以定量限制備的樣品來驗證。
e．選擇性(selectivity)
是指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時該分析方法對供試物質(zhì)準(zhǔn)確而專屬的測定能力。
它與專屬性(specificity)的含義稍有不同。專屬性是指一種方法僅對一種分析成分產(chǎn)生**信號；選擇性則可對多種化學(xué)成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，而主要成分的響應(yīng)可與其它響應(yīng)區(qū)分。
因此，選擇性是指該法用于復(fù)雜樣品分析時相互干擾程度的量度。
在**分析中考察一個分析方法的選擇性時，應(yīng)著重考慮雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物以及制劑輔料等其他組分是否對被測**的測定有干擾。一般，通過添加上述物質(zhì)的樣品與未曾添加的樣品所得分析結(jié)果進行比較而確定。
f．線性與范圍 (linearity and range)
分析方法的線性是在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗結(jié)果的能力。換句話說，就是供試物濃度的變化與試驗結(jié)果(或測得的響應(yīng)信號)成線性關(guān)系。
所謂線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其*大量與*小量之間的間隔，可用mg／L ~ mg／L、 ug／ml ~ ug／ml等表示。
線性與范圍的確定可用作圖法(響應(yīng)值Y／濃度X)或計算回歸方程(Y＝a+bX)來研究建立。
測定樣品時所有生物**分析方法都必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，方法應(yīng)與分析方法考核時完全一致。標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯度的5-8個濃度(非線性者如**分析可適當(dāng)增加)，每個濃度只需測定一次(**分析可測定兩次并取均值)；標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品可能的濃度范圍，對于含量測定要求一般濃度上限為樣品*高濃度的120％，下限為樣品*低濃度的80％ (但應(yīng)高于LOQ)；目前仍廣泛采用相關(guān)系數(shù)(r)表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度、并控制r≥0.9900。對照品的LOQ必須包括在線性范圍。
g. 耐用性 (robustness)
是指利用相同的方法在各種正常實驗條件下對同一樣品進行分析所得結(jié)果的重現(xiàn)程度。
所謂各種正常實驗條件，包括不同的實驗室、不同的分析人員、不同的儀器、不同批號的試劑、不同的測試耗用時間、不同的分析溫度、不同的測定日期等等。分析方法重現(xiàn)性的測定是通過在不同實驗室由不同的實驗者(操作和環(huán)境條件雖有差別但仍在規(guī)定的分析參數(shù)內(nèi))對同一樣品的分別測試而獲得的。
h、重現(xiàn)性 (ruggedness)
即是指在不同實驗室中使用此種分析方法的精密度。
是評價其保持不受參數(shù)微小變差影響的能力，并可作為正常使用的一個可靠性指標(biāo)。
i. 與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度的比較
由于生物樣品中含有許多干擾測定的雜質(zhì)，特別是與原型**相似的代謝物常對**的測定有影響。因此，除考察選擇性外，有時還用參比方法對實際生物樣品同時測定并進行比較。比較試驗時，取若干份實際樣品
(如病人服藥后采取的血樣)，用一個已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時進行測定，以參比方法測得的藥濃為橫坐標(biāo)(X)，以新建立方法測得的藥濃為縱坐標(biāo)(Y)作成散布圖(scatter diagram)，并求出直線回歸方程 (y＝a+bx)及相關(guān)系數(shù) (r)。r*大值為1，表示兩法完全相關(guān)(結(jié)果完全吻合)；r＝0時，表示兩法完全不相關(guān)。一般要求兩法的相關(guān)系數(shù)r＞0．95，而相關(guān)直線的斜率 (b) 應(yīng)接近于1。
評價一種分析方法的效能，并不一定對上述各項指標(biāo)都有要求。一般．根據(jù)方法的使用對象有所區(qū)別。大體上有以下四種情況：
A．用于原料藥中主要組分或制劑中有效組分含量測定的方法：除了檢測限和定量限二項指標(biāo)外，對精密度、準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、耐用性等均應(yīng)有所要求；
B．用于原料藥中雜質(zhì)測定或制劑中降解產(chǎn)物測定的方法又可分為兩種：①用于含量測定；②用于限度檢查。
對于①法的要**：除檢測限和精密度指標(biāo)不必要求外，對準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、定量限、耐用性等均應(yīng)有所要求；
對于②法的要**：只??檢測限、選擇性和耐用性三項指標(biāo)有所要求，其余均無需要求。
C．用于溶出度測定的方法及**釋放度測定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余項目均不作要求。
D．用于生物樣品中**測定的方法，對精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、選擇性、可測線性范圍、定量限、對生物樣品的耐用性以及與參比方法測得結(jié)果的相關(guān)程度的比較等指標(biāo)應(yīng)有所要求。

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