酶聯(lián)**吸附測定（ELISA）是一種廣泛應用于檢測抗原或抗體的高靈敏度**學技術。其基本原理是將抗原或抗體固定在固相載體（如96孔板）上，通過特異性結合與酶促顯色反應，實現(xiàn)對目標物質的定性或定量分析。根據(jù)檢測目標不同，常用方法有雙抗體夾心法（測抗原）和間接法（測抗體），但基礎操作流程高度相似。

以下是普通ELISA（酶聯(lián)**吸附試驗）的標準操作步驟詳解，結合了常規(guī)流程和關鍵注意事項：

?一、實驗前準備?

1、?試劑與耗材

包被抗原/抗體的微孔板

酶標二抗（如HRP標記抗體）

洗滌緩沖液（PBS-Tween 20）

封閉液（1-5% BSA或脫脂奶粉）

顯色底物（如TMB）及終止液（2M H?SO?）

標準品、待測樣本

2、?設備

酶標儀、洗板機、移液器、恒溫孵育箱

?二、操作步驟詳解?

?1.包被（Coating）?

?操作?：將抗原/抗體稀釋后加入微孔板（通常100μL/孔），4℃過夜或37℃孵育2小時。

?關鍵點?：

包被緩沖液常用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液。

包被后需用洗滌液（PBS-Tween 20）洗板3次，去除未結合物質。

?2.封閉（Blocking）?

?操作?：加入封閉液（如1% BSA），37℃孵育1-2小時，封閉非特異性結合位點。

?關鍵點?：

封閉后需再次洗板3次，避免殘留封閉液干擾后續(xù)反應。

?3.加樣與孵育?

?操作?：

加入標準品和待測樣本（100μL/孔），37℃孵育1小時。

洗板后加入酶標二抗（100μL/孔），37℃孵育1小時。

?關鍵點?：

樣本需稀釋至線性范圍內(nèi)，避免高濃度導致鉤狀效應。

孵育時間需嚴格控制，避免過度反應。

?4.顯色與終止?

?操作?：

加入TMB底物（100μL/孔），避光室溫孵育10-30分鐘。

加入終止液（50μL/孔），溶液由藍變黃。

?關鍵點?：

顯色時間需一致，避免過度顯色導致背景升高。

?5.檢測與分析?

?操作?：用酶標儀在450nm波長讀取吸光度值（OD值）。

?關鍵點?：

以標準品濃度（X軸）和OD值（Y軸）繪制標準曲線，計算樣本濃度。

?三、注意事項?

1、?洗滌徹底?：每次孵育后需洗板3-5次，避免殘留物干擾。

2、?避免污染?：使用一次性槍頭，防止交叉污染。

3、?溫度控制?：孵育溫度和時間需嚴格一致。

4、?質控設置?：每板需設置空白孔（僅加底物）和陰性/陽性對照。

?四、常見問題與解決?

?高背景?：可能因封閉不充分或洗滌不徹底，需優(yōu)化封閉液濃度和洗滌次數(shù)。

?標準曲線不佳?：檢查標準品稀釋是否準確，或重新包被微孔板。

?五、應用場景?

?普通ELISA?：適用于檢測濃度較高的目標物（如炎癥標志物、**等）。

?超敏ELISA?：若需檢測飛克級低豐度蛋白（如細胞因子），需采用TSA等信號放大技術。

通過規(guī)范操作和嚴格質控，普通ELISA可穩(wěn)定用于臨床診斷和科研實驗。