TaqMan探針是一種用于實時熒光定量PCR（qPCR）的熒光標記寡核苷酸，它由5'端的熒光報告基團和3'端的淬滅基團組成。TaqMan探針設計是實時熒光定量PCR（qPCR）中的關鍵環節，其質量直接影響實驗的準確性和靈敏度。以下是主要注意事項：

1、探針基本結構要求：

l ?標記基團?：5'端標記熒光報告基團（如FAM、HEX），3'端標記淬滅基團（如BHQ、TAMRA）?。

l ?長度?：通常為25-35 bp（MGB探針可縮短至13-25 bp），確保特異性結合。

l ?Tm值?：比引物高5-10℃，推薦65-72℃（MGB探針需額外調整）。

2、避免二聚體和發卡結構：

設計時要避免探針內部或探針與引物之間形成發夾結構或二聚體，這可能影響探針的結合效率和特異性。

3、熒光基團與淬滅基團的選擇：

熒光基團和淬滅基團的選擇應與qPCR儀器兼容，且熒光基團的發射光譜應與淬滅基團的吸收光譜重疊，確保熒光信號的**檢測。

常用的淬滅基團包括BHQ系列、MGB、TAMRA和Eclipse，選擇時需考慮其淬滅效率和光譜特性。

4、序列保守性：

探針必須高度保守，確保目標序列的特異性檢測。

選擇GC含量在30-80%之間，避免多個連續的G堿基，且5’端避免G堿基，因為G可能淬滅熒光。

5、多重qPCR兼容性：

如果需要進行多重qPCR，探針應使用不同的熒光基團，以便區分不同的靶基因。

其他關鍵點：

l ?純化要求?：長探針（>50 bp）需純化去除截斷序列。

l ?濃度優化?：引物濃度0.1-0.5 μM，探針濃度需通過實驗驗證。

l ?軟件輔助?：推薦使用PrimerExpress等工具綜合評估Tm值、GC含量等參數。

6、建議與要點回顧：

l 探針設計前務必進行序列比對，確保特異性；

l 使用專業軟件（如Primer Express、Oligo）輔助設計；

l 探針的5’端避免G，GC含量適中，Tm值高于引物；

l 實驗前通過軟件評估探針的二聚體和發夾結構風險；

l 探針與引物的位置關系要合理，避免空間位阻。

遵循這些原則可以幫助確保TaqMan探針的有效設計，從而提高qPCR實驗的準確性和重復性。