為確保ELISA試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,需從?操作規(guī)范、質(zhì)控措施、注意事項(xiàng)?三方面嚴(yán)格把控。以下是具體要點(diǎn):
一、規(guī)范操作流程
1、?加樣規(guī)范
使用校準(zhǔn)后的移液器,選擇密封性好的吸頭,避免漏液或氣泡。
垂直懸空加樣,避免液體濺到孔壁或產(chǎn)生氣泡,若濺出需用吸水紙吸干并記錄。
標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議設(shè)置復(fù)孔,通過平均值減少誤差,并評估操作精密度。
2、?孵育與洗滌
孵育時推薦震蕩(如水平振蕩器),促進(jìn)抗原抗體充分結(jié)合,提高反應(yīng)效率。
手工洗板需垂直拍干,避免交叉污染;機(jī)器洗板需檢查沖洗頭是否堵塞。
3、?顯色與終止
顯色時間需嚴(yán)格控制(通常10-20分鐘),避免過度反應(yīng)導(dǎo)致假陽性。
終止反應(yīng)后需立即讀數(shù),延遲可能導(dǎo)致結(jié)果偏差。
二、嚴(yán)格質(zhì)控措施
1、?實(shí)驗(yàn)前檢查
確認(rèn)試劑盒在有效期內(nèi),各組份(如標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)板)無破損或污染。
校準(zhǔn)儀器(如酶標(biāo)儀、恒溫箱),確保設(shè)備狀態(tài)正常。
2、?實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)控
使用質(zhì)控品(如高、中、低濃度)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性,避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白變性。
標(biāo)準(zhǔn)品需嚴(yán)格按說明書溶解和稀釋,避免吹吸未完全溶解的蛋白。
3、?結(jié)果分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值應(yīng)≥0.99,復(fù)孔CV值需<15%。
若結(jié)果異常,需排查加樣誤差、洗滌不充分或試劑失效等問題。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、?試劑與樣本處理
所有試劑和樣本需平衡至室溫后再使用,避免溫度差異影響反應(yīng)動力學(xué)。
凍存樣本需在2-8℃解凍,避免室溫直接解凍導(dǎo)致蛋白降解。
2、?操作細(xì)節(jié)
避免交叉污染:每孔更換槍頭,不同樣本分開操作。
顯色時需避光,防止光敏試劑失效。
3、?儲存條件
未使用的酶標(biāo)板需密封保存,液體試劑(如抗體)需按說明書要求儲存(如2-8℃或-20℃)?。
四、常見問題自查
若結(jié)果異常,可參考以下步驟排查:
檢查加樣是否準(zhǔn)確,排除漏液或氣泡干擾。
確認(rèn)洗滌是否充分,避免殘留物導(dǎo)致高背景。
驗(yàn)證試劑是否過期或儲存不當(dāng)。
通過以上規(guī)范操作、質(zhì)控和注意事項(xiàng),可顯著提升ELISA檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。