分離PBMC（外周血體積5ml~20ml ）
說(shuō)明：
這個(gè)細(xì)胞是多能間分離PBMC（外周血體積5ml~20ml ），又名間充質(zhì)干細(xì)胞，是特征明確的一類干細(xì)胞。它們有發(fā)育為成熟細(xì)胞的潛在能力而產(chǎn)生脂肪、軟骨、骨骼和肌肉。這些特性與它們發(fā)育中的可塑性共同作用使人們對(duì)用間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)替換受損組織的潛在能力產(chǎn)生了極大的興趣。間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子作用下會(huì)分化成軟骨細(xì)胞。相反，在有血清、抗壞血酸和地塞米松的作用下會(huì)分化成成骨細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞有能力更新和分化成多種間充質(zhì)組織。間充質(zhì)干細(xì)胞由羊膜和絨毛膜中提取得到，表達(dá)的CD271控制心肌細(xì)胞的特征、并有多種抗血管生成蛋白和**癥蛋白。
的種類和表面標(biāo)記
通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干細(xì)胞，骨髓中絕大多數(shù)是HSC，BMSC 只占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.01% 。因此鑒定BMSC 的方法是在骨髓的干細(xì)胞中排除HSC——BMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。
間質(zhì)分離PBMC（外周血體積5ml~20ml ）培養(yǎng)原理概述
間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可分化成多種組織細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。
間質(zhì)干細(xì)胞*早是從骨髓中分離得到的，正常情況下，它在骨髓中的比例非常低，僅占單核細(xì)胞的1/105 ~1/104 。骨髓中單個(gè)核細(xì)胞包括**細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而**細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/ml，血小板為1.030~1.035 g/ml。為此利用一種密度介于1.075~1.092 g/ml之間而近于等滲的溶液（分層液）進(jìn)行密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
在骨髓的原代培養(yǎng)物中，除了貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣的間質(zhì)干細(xì)胞外，還混雜著一些巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞及紅細(xì)胞等，要得到較均一的間質(zhì)干細(xì)胞，必須除去其他細(xì)胞。根據(jù)其他細(xì)胞的特性，可采用不同的方式排除它們。對(duì)于紅細(xì)胞，因其不貼壁，可通過(guò)換液除去。對(duì)于貼壁的單核巨噬細(xì)胞，可根據(jù)其黏附能力的不同，通過(guò)調(diào)整Trypsin/EDTA 的消化時(shí)間，保證間質(zhì)干細(xì)胞在短暫的作用時(shí)間內(nèi)與塑料培養(yǎng)瓶壁分離，而巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、造血細(xì)胞等仍貼附于培養(yǎng)瓶壁，從而使間質(zhì)干細(xì)胞與其他的貼壁細(xì)胞得到分離。
分離PBMC（外周血體積5ml~20ml ）在傳代培養(yǎng)中，接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí)，間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高，而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度，這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。而在培養(yǎng)過(guò)程中，若細(xì)胞過(guò)度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向，故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài)，要及時(shí)傳代。