【產品簡介】

硝基呋喃類**因有非常好的**作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。呋喃唑酮在1995年被禁用。由于硝基呋喃類**在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，所以管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。

呋喃唑酮代謝物快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于動物組織（水產、雞、豬、牛）、牛奶等大批量樣品中的呋喃唑酮代謝物快速檢測。

呋喃唑酮試劑盒【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產等組織樣本中的AOZ，在微孔條上預包被上偶聯抗原，利用抗原與抗體的特異性**化學反應的原理來進行的，樣本中的AOZ和微孔條上預包被偶聯抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的AOZ含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物含量。

【試劑盒技術指標】  

規       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.02ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

水產品、動物組織……………………… 0.3ppb

蜂蜜、牛奶……………………………… 0.3ppb

參考標準GB/T 21311-2007 檢測下限為0.5ppb

交叉反應率：

呋喃唑酮代謝物  …………………………  100%

呋喃它酮代謝物  …………………………﹤0.1%

呋喃妥因代謝物  …………………………﹤0.1%

呋喃西林代謝物  …………………………﹤0.1%

回收率：

組織…………………………………………90%±15%

蜂蜜…………………………………………85%±15%

【試劑盒組成】 

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.02ppb、0.06ppb、0.18ppb、0.54ppb、1.62ppb

3、 酶標記物    7ml………………………紅色帽

4、 抗體工作液 7ml………………………綠色帽

5、 底物A液   7 ml………………………棕色帽

6、 底物B液   7 ml………………………黑色帽

7、 終止液     7 ml………………………黃色帽

8、 20X濃縮洗滌液40 ml………………白色帽

9、 2X濃縮復溶液 50 ml……………… 藍色帽

10、衍生化試劑     0ml ………………  黑色帽

呋喃唑酮試劑盒【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl

試          劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、磷酸氫二鉀、濃HCl

【實驗前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加去離子水溶解定容至500ml。

配液4、1M HCl溶液

取8.6ml濃HCl加去離子水定溶至100ml。

配液5、1M NaOH溶液

               取4gNaOH加去離子水定容至100ml。

呋喃唑酮試劑盒【樣本前處理方法】  

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理步驟：

樣本的處理方法：

該方法為氯霉素和硝基呋喃類四項同時檢測的五合一前處理方法；用本方法制備出的樣品提取溶液可以直接同時應用于本公???研發的氯霉素和呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物檢測試劑盒。(備注：使用該五合一前處理方法檢測氯霉素時，因存在一定的干擾；樣本檢測下限為0.3ppb）

(a) 水產、組織、蜂蜜、奶粉（牛奶）

1、 取2±0.05g均質樣本樣本，加入 4ml的去離子水，0.5ml1M HCl和100μl衍生化試劑，充分振蕩。

2、 置于37℃恒溫箱孵育過夜（大約16h）或56℃水浴中孵育2h；

3、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml

      乙酸乙酯，充分振蕩2min；

4、 在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。

5、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中

于50℃氮氣/空氣吹干。

6、 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀釋

好的復溶液充分混合30s；在室溫下（20-25℃）

4000r/min以上離心10min。

7、 取50μl下層用于分析。

樣本稀釋倍數：1

(b) 特殊樣本(畜禽產品組織、肝臟、腸衣、油炸食品、混合肉餡、熟食等)的處理方法

1、 取2±0.05g的均質樣本于50ml離心管中，6ml的去離子水，充分振蕩2min，加入5ml正己烷，充分混合震蕩3min,4000r/min離心10min。

2、 棄除上層有機相液體，吸取4ml下層清澈液體于另一個50ml離心管中，加0.5ml1M HCl和100μl衍生化試劑，充分振蕩。

3、 置于37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

4、 分別加入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充分振蕩2min；在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。

8、 取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于50℃氮氣/空氣吹干。

9、 用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml已稀釋好的復溶液充分混合30s在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min。

10、取出50μl下層用于分析。

 樣本稀釋倍數：2

呋喃唑酮試劑盒【酶標**分析程序】 

1、  從4℃冷藏環境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、  取出需要數量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、  配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、  編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、  加標準品/樣本 50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50μl/孔,然后加入抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環境中反應30min。

6、   取出將孔內液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、   顯色：每孔加入底物A液50μl，再加底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環境中避光顯色15min。

8、   測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

【結果判定】 

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與AOZ的含量成負相關。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含AOZ濃度范圍（ng/ml）。假設樣品1的吸光度值為0.268，樣品2的吸光度值為1.230，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.671；0.02ppb為1.425；0.06ppb為1.103； 0.18ppb為0.567； 0.54ppb為0.205； 1.62ppb為0.104。則樣品1的濃度范圍是0.18ppb-0.54ppb；樣品2的濃度范圍是0.02ppb-0.06ppb。

乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AOZ實際濃度。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以AOZ標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AOZ實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準曲線：

B/B0 (%)

       0.02         0.06         0.18         0.54       1.62

AOZ(ppb) [μg/kg]

圖1： 呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的回歸曲線 

4、再現性：

%CV

      0     0.02     0.06     0.18   0.54    1.62

AOZ(ppb) [μg/kg]

      圖2：呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應呋喃唑酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】 

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、  顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、  該試劑盒*佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

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