【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺苯酰與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺的抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含磺胺類**的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物磺胺類**的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度：0.2ppb

檢測時(shí)間： 45min

磺胺類試劑盒樣本檢測下限：

組 織 （高檢測限方法）……………………………0.2ppb

組 織 （低檢測限方法）……………………………1ppb

 蜂 蜜…………………………………………………0.2ppb

血 清 、 尿 液  ………………………………………0.8ppb

牛  奶………………………………………………  4ppb

樣本回收率：

組  織 、 蜂 蜜 ………………………………  85% ±25%

尿樣、牛奶、血清…………………………  70% ±20%

 交 叉 率 ：

磺胺嘧啶（SD或SDZ）……………………………100 %

磺胺甲基嘧啶（SM1 ）…………………………… 82%

磺胺二甲基嘧啶（SM2）  ………………………… 121%

    由交叉率可以得出：該試劑盒可用于磺胺多種殘留物的檢測，完全滿足國家磺胺類多殘留種類檢測的要求。

磺胺類試劑盒【試劑盒組成】  

1．   微量測試孔：每條8孔，一板12條

2．   標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.2ppb、0.6pb、 1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

3．   酶標(biāo)記物     7ml ………………………  紅色帽

4．   抗體工作液 7ml ………………………  綠色帽

5．   底物A液    7ml …………………………白色帽

6．   底物B液　 7 ml …………………………黑色帽

7．   終止液     7 ml …..……………………  黃色帽

8．   20X濃縮洗滌液40 ml ………………… 透明帽

9．   2X濃縮復(fù)溶液 50 ml …………………  藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl

試 劑：乙酸乙酯、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOH NaH₂PO₄·2H₂O、濃HCL、二氯甲烷

【樣本前處理步驟】  

樣本前處理須知

      處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

磺胺類試劑盒樣本前處理需配制：

配液1、0.2M NaOH溶液稱取0.8gNaOH用去離子水100ml溶解。

配液2、0.5M鹽酸溶液4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。

配液3、0.02M PB緩沖液稱取2.58g Na₂HPO₄·12H₂O和0.44g NaH₂PO₄·2H₂O加去離子水500ml溶解。

   配液 4、乙腈-二氯甲烷混合溶液V乙腈-V二氯甲烷  =  1 : 4

   配液5、樣本復(fù)溶液：將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水以1：1稀（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于樣本提取后的復(fù)溶。

（a ）組織高檢測限處理方法一：

1、稱2.0±0.05g均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩2min，4000r/min以上，15℃離心10min；

2、取4ml上層清澈有機(jī)相至干燥溶器中，56℃氮?dú)獯蹈?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；

3、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、去除上層取下層50μl液體用于分析

      樣本稀釋倍數(shù)：1倍

（b）組織高檢測限處理方法二：

1、稱取3±0.05g勻漿物置離心管中，先加入3ml0.02M  PB緩沖液充分振蕩混勻，再加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振蕩10min，于15℃，4000r/min以上速度離心10min；

2、移取2ml上層液體（約相當(dāng)于1g的樣本）在50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?

3、加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩1min，室溫4000r/min，離心5min，除去上層液；

4、取50μl下層用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1倍

注：在使用國家規(guī)定*高殘留限量（100ppb）進(jìn)行判定時(shí)，需進(jìn)行5倍稀釋（1份樣本液+4份已稀釋好的復(fù)溶液）。

（c） 組織低檢測限處理方法

1、稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；加入8ml0.02M  PB緩沖液，充分振蕩2min，于15℃，4000r/min以上速度離心10min

2、取50μl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：5倍

（d） 血清樣本

1、將血樣本于室溫放置30min，于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；

2、   取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合，混合30s；

3、   取50μl液體用于分析。

   樣本稀釋倍數(shù)：4倍

（e）蜂蜜

1、 稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；

2、   加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心10min；

3、   取2ml上層液體于50℃下氮?dú)獯蹈桑?.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；

4、   取50μl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：1倍

（f）尿液

1、 用3ml0.02 MPB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；

2、   取50μl液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：4倍

（g）牛奶

1、取1ml牛奶樣本用0.02 MPB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋（即20μl牛奶+380μl0.02  MPB緩沖液），混合30s；

2、取50μl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：20倍     

磺胺類試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

測定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃環(huán)境。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

操作步驟：

1、   將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、   按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、  配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、  編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、   加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50μl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

6、   取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、   顯色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

8、   測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】  

         結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與磺胺類**的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類**實(shí)際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類**濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類**實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

        0.2            0.6              1.8               5.4          16.2

 (ppb) [μg/kg]

圖1：磺胺類**檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

         0      0.2        0.6          1.8       5.4       16.2

(ppb) [μg/kg]

圖2：磺胺類**檢測試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出磺胺類藥檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)磺胺類藥濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、    使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、    在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、    混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、    反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、    不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、    不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、    顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、    該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

 原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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