【測(cè)定原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)牛奶和水產(chǎn)等樣本中的三聚氰胺，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性**化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的三聚氰胺含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 1ppb

檢測(cè)時(shí)間： 75min

三聚氰胺試劑盒樣本檢測(cè)下限：

奶粉………………………………………………20 ppb

牛奶………………………………………………16 ppb

牛奶/奶 粉（處理法二）………………………  1 ppb

組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）……………………2 ppb

飼   料  …………………………………………100 ppb

蛋   類   …………………………………………20 ppb

血   清  …………………………………………  4 ppb

交叉反應(yīng)率

三聚氰胺  …………………………………………100%

三聚氰酸……………………………………………60%

三   嗪  ……………………………………………< 1%

三嗪二銨…………………………………………< 1%

回收率

牛奶/奶 粉  ……………………………………90±15%

組    織  …………………………… 85±10%

飼    料  …………………………… 85±10%

蛋    類  …………………………… 80±10%

【試劑盒組成】  

1、    微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、    標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、    酶標(biāo)記物    12ml………………… 紅色帽

4、    抗體工作液  7ml………………… 綠色帽

5、    底物A液     7 ml………………… 棕色帽

6、    底物B液     7 ml …………………黑色帽

7、    終止液     　7 ml …………………黃色帽

8、    20X濃縮洗滌液40 ml……………白色帽

9、    2X濃縮復(fù)溶液 50 ml ……………藍(lán)色帽

三聚氰胺試劑盒【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔板、酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20ul～200ul、100ul～1000ul

多道 250 ul

試     劑：乙腈、氫氧化鈉 、濃鹽酸、去離子水、正己烷、甲醇

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌液。

配液3   1M HCl 溶液取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。

配液4   1M NaOH 溶液稱取4g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液5   0.1M NaOH 溶液稱取0.4g NaOH加去離子水定容100ml。

配液6   乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml0.1MNaOH混合均勻。

【樣本前處理步驟】  

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。

（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

三聚氰胺試劑盒樣本處理方法

（a）牛奶專用樣本處理方法：

1、取牛奶樣本600μl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min以上離心5min；

2、取100μl上清液，再加入500μl復(fù)溶液(見配液1)，混勻???

3、取50μl用于分析。

        樣本稀釋倍數(shù):16倍

（b）奶粉專用樣本處理方法：

1、稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；

2、15℃4000r/min以上離心10min，取100μl上清液，再加入900μl復(fù)溶液(見配液1)，混勻；取50μl用于分析。

          樣本稀釋倍數(shù):20倍

（c）飼料樣品處理方法：

1、將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml1MHCl，加入16ml去離子水均質(zhì)。

2、旋流1min，放振蕩器上振蕩2min15℃4000r/min以上離心15min，取出10ml上清液并用1MNaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼

     料樣品的不同，加入1MNaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）。

3、15℃，4000r/min以上離心15min，吸出上清液。（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）。

4、用稀釋后的復(fù)溶液10倍稀釋上清液（取100μl上清液加入900μl稀釋后的復(fù)溶液，并且混合均勻，混合30s）。

5、取50μl進(jìn)行分析

      樣本稀釋倍數(shù):100倍

（d）牛奶/奶粉樣本處理方法（處理法二）：

1、取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取4ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔?/span>至完全干燥；

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取50μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1倍    定量下限定為：2ppb

（e）組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：

1、取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取2ml

    上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?/span>

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取50μl用于分析。

       樣本稀釋倍數(shù)：2 倍   

（f）蛋類樣本處理方法：

1、用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min；（注：蛋 清含蛋白成份高，加入提取液后會(huì)形成一團(tuán)膠狀物，較蛋黃或全蛋難易搖勻，此情況為正常現(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）15℃， 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆稍铮?/span>

2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

3、取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1：3 （50μl樣本液加150μl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

4、取50μl用于分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：20倍

（g）血清樣本處理方法：

1、取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；

2、加入2ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵镣耆?

     燥；

3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；

4、取50μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4 倍

三聚氰胺試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

1、從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、每孔加入酶標(biāo)記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水

     紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、顯色：每孔加入底物A液50μl，再加底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)

     定每孔OD值。

【結(jié)果判定】  

 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。

2、定量判定：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大

量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

         1                 3                9               27               81

 (ppb) [μg/kg]

圖1：三聚氰胺檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

                 0        1          3         9          27        81

(ppb) [μg/kg]

圖2：三聚氰胺檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出三聚氰胺檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)三聚氰胺濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一

     步操作。

3、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

 原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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