【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物四環素類**將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭四環素類**抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物四環素類**的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物四環素類**的含量。

【試劑盒技術指標】  

規      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測時間： 75min

四環素試劑盒樣本檢測下限：

組織樣本（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚、雞蛋）：

四環素 ………………………………………………1ppb

二甲胺四環素 ………………………………………1ppb

吡四環素 ……………………………………………1ppb

金霉素 ………………………………………………1ppb

脫甲基金霉素……………………………………… 2ppb

土霉素………………………………………………2ppb

強力霉素……………………………………………2ppb

牛奶、蜂蜜樣本：

四環素……………………………………………… 2ppb

二甲胺四環素………………………………………2ppb

吡四環素…………………………………………… 2ppb

金霉素 ………………………………………………2ppb

脫甲基金霉素………………………………………3ppb

土霉素………………………………………………3ppb

強力霉素……………………………………………4ppb

交叉反應率：

四環素 ……………………………………………100%

二甲胺四環素…………………………………… 125%

吡四環素 ………………………………………… 110%

金霉素 …………………………………………… 100%

脫甲基金霉素…………………………………… 85%

土霉素 …………………………………………… 88%

強力霉素 ………………………………………… 49%    

 樣本回收率：

組     織   …………………………………… 85%±20%

牛奶、蜂蜜  ………………………………  80%±20%

四環素試劑盒【試劑盒組成】

1、      微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、      標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、      酶標記物 12ml…………………………紅色帽

4、      抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

5、      底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、      底物B液     7ml  ……………………黑色帽

7、      終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

8、      20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

9、      2X 濃縮復溶液   50ml ·………………藍色帽

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20μl～200μl、單道100μl～1000μl、多道 30～300 μl

試           劑： 甲醇、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOHNaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

四環素試劑盒【實驗前溶液配制】

配液1、20mM PBS緩沖液5.16gNa2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；加入蒸餾水至1000ml；用于樣品提取液

           的配制。

配液2、樣品提取液的配制取1ml甲醇與9ml的20mMPBS緩沖液混勻。

配液3、 將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復溶)。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌

           液。

【樣本前處理步驟】

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，

必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本處理：

（a）組織樣本前處理方法（不用過柱）

1、 稱取1±0.05g 均質后的樣本于離心管中，加入4ml樣品提取液，振蕩5min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一試管中;加入1ml 正己烷,振蕩1min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

3、 取50 μl下層液體于另一容器中，加入200μl樣本稀釋液混合30s；

4、 取50 μl 用于分析

    樣本稀釋倍數: 20 倍

（b）蜂蜜處理方法

1、 準確稱取1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入4ml 樣品提取液，強烈混合振蕩5min，室溫 4000r/min以上，離心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一試管中，加入450μl樣本稀釋混合30s；

3、 取50 μl 用于分析

樣本稀釋倍數: 40 倍

（c）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶與1950μl樣本稀釋液，混30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環境3000r/min，離心10min；（如果沒有冷凍離心機請預先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于與1950μl樣本稀釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   樣本稀釋倍數: 40 倍

【 酶標**分析程序】

u 操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、加標準品/樣本50μl /孔，再加入抗體工作液50μl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應30min。

5、取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應30min。重復步驟6。

7、顯色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。

8、測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。

四環素試劑盒【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含四環素的含量成負相關。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1 的吸光度值為0.3，樣本2 的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb 為2.243； 0.05ppb 為1.816；0.15ppb 為1.415；0.45ppb 為0.74；1 .35ppb 為0.313；4 .05ppb 為0.155。則樣本1 的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中四環素實際濃度。           

1、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以四環素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中四環素實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準曲線：

B/B0 (%)

        0.05           0.15            0.45           1.35         4.05

四環素(ppb) [μg/kg]

圖1：四環素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV

             四環素(ppb) [μg/kg]

           圖2：四環素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出四環素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應四環素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一

     步操作。

3、混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、該試劑盒*佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

 原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

 有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

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