已烯雌酚試劑盒

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。

已烯雌酚試劑盒【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間： 75min

樣本定量檢測下限

組織（蝦、魚）……………………………………0.2ppb

豬肉/肝 雞肉/肝 ……………………………………  2ppb

飼料………………………………………………… 20ppb

尿液…………………………………………………0.6ppb

交叉反應(yīng)率

己烯雌酚………………………………………………100%

雌三醇…………………………………………… < 0.1%

樣本回收率

飼  料……………………………………………90±10%

組  織……………………………………………85±10%

尿  液……………………………………………70±10%

【試劑盒組成】  

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、酶標(biāo)記物      12ml………………………………紅色帽

4、抗體工作液    7ml………………………………藍色帽

5、底物液 A液   7ml………………………………白色帽

6、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

7、終 止 液        7ml……………………………… 黃色帽

8、20X濃縮洗滌液  40ml…………………………白色帽

9、5X濃縮復(fù)溶液   50ml…………………………透明帽

已烯雌酚試劑盒【所用儀器、試劑】  

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

試            劑：乙酸乙酯、正己烷、

【實驗前溶液配制】

配液1、將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：4稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+4份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理方法

（a）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）

1、  用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

2、  稱3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

3、  取出4ml上層液體在氮氣流50-60℃水浴中干燥；

4、 加入1ml稀釋后的復(fù)溶液強烈振蕩混合30s，再加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物室溫4000r/min以上離心5min。

5、  取50 μl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5    

用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

不同樣本按如下方法稀釋：

 蝦魚：直接取50μl水相用于檢測。

 豬肉/肝、雞肉/肝：取50μl水相加入450μl稀釋后的復(fù)溶液，渦動混合30s；取50μl用于檢測。

 蝦魚稀釋倍數(shù)：2      

 豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20

已烯雌酚試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

操作步驟：

1、      從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、      取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、      編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、      加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、      取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍

           頭刺破）。

6、      每孔加入酶標(biāo)記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。重復(fù)步驟6。

7、      顯色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、      測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)

           據(jù)），測定每孔OD值。

已烯雌酚試劑盒【結(jié)果判定】  

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含己烯雌酚成負相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

B/B0 (%)

                                      己烯雌酚(ppb) [μg/kg]

                         圖1：己烯雌酚檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性

%CV

                          己烯雌酚(ppb) [μg/kg]

                圖2：己烯雌酚檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出己烯雌酚檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)己烯雌酚濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】  

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下

      一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

 原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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