黃曲霉**B1試劑盒

【產品簡介】

黃曲霉**是一類**（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關的產品中。其中黃曲霉**B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。薄層色譜一直是檢測黃曲霉**常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時費時又費力。而使用黃曲霉**B1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉**B1殘留。參考國家標準GB/T 5009.22-2003。

黃曲霉**B1試劑盒【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物黃曲霉**B1和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭黃曲霉**B1抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉**B1的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物黃曲霉**B1的含量。

【試劑盒技術指標】  

規       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.025ppb

檢測時間： 75min

樣本檢測下限：

大米、玉米、小米………………………………2.5ppb

醬油、醋…………………………………………0.5ppb

食用油……………………………………………2.5ppb

酒類（葡萄酒、啤酒、黃酒）…………………0.5ppb

花    生……………………………………………2.5ppb

月餅、桃酥、花生醬等……………………………1ppb

面    粉………………………………………………1ppb

一般飼料…………………………………………2.5ppb

飼料（配合料及濃縮料）…………………………1ppb

牛奶………………………………………………0.5ppb

反應率：

黃曲霉**B1……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

飼    料…………………………………………75±10%

黃曲霉**B1試劑盒【試劑盒組成】  

1、     微量測試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條

1、     標準液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb

2、     酶標記物       12ml…………………………紅色帽

3、     抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

4、     底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

5、     底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、     終 止 液          7ml…………………………黃色帽

7、     20X濃縮洗滌液40ml…………………… 透明帽

8、     5X濃縮樣品稀釋液50 ml…………………藍色帽

【所用儀器、試劑】  

儀          器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量

                   0.01g）

微量移液器：單道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

試           劑：甲醇、三氯甲烷、正己烷、濾紙

黃曲霉**B1試劑盒【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

樣本前處理需配制：

配液1、50%甲醇溶液：50ml蒸餾水或去離子水和50ml純甲醇混合制備50％甲醇溶液。

配液2、將5X濃縮樣品液用去離子水按照1：4稀釋（1份濃縮樣品液+4份去離子水）用于樣品的稀釋。

一、食品

l、脂肪含量小的固體樣品(如大米、玉米、小米等)

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min。

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與樣品稀釋液450ul 充分混合30s取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數:100

2、醬油、醋

1、稱取2g樣品于50ml離心管中；先加入3ml去離子水充分混勻，再加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

2、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

4、取50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數:20

3、食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)

1、稱取1g油樣品于50ml離心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層溶液50ul與樣品稀釋液450ul 充分混合30s取50ul進行分析。

     樣本稀釋倍數:100

4、酒類（葡萄酒、啤酒、黃酒）

1、稱取2g酒樣品于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

2、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

4、取50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行分析。

      樣本稀釋倍數:20

5、花生

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層溶液50ul與樣品稀釋液450ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

     樣本稀釋倍數:100

6、月餅、桃酥、花生醬等

1、稱取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層5mL提取液于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

3、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

4、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

5、取50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數:40倍

7、面粉

1、稱取2g面粉樣品于50ml離心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取過濾溶液5mL于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

4、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

6、取50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行分析。

       樣本稀釋倍數:40倍

二、飼料

1、一般飼料及原料（脂肪和蛋白含量小的飼料)

1、稱取1g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與樣品稀釋液450ul 充分混合30s取50ul進行分析。

          樣本稀釋倍數:100

2、配合料及濃縮料（脂肪和蛋白含量高的飼料)

1、稱取2g樣品于50ml離心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；

2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。

3、取過濾溶液5mL于50ml離心管中；加入10ml三氯甲烷，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

4、取出下層5ml的三氯甲烷到另一潔凈容器中于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

5、加入1mL的50%甲醇溶液將充分溶解干燥物。

6、取50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行分析。

        樣本稀釋倍數:40倍

三、乳制品

1、生鮮牛奶；

1、直接取50μl牛奶+950μl樣品稀釋液混合30s；

  2、取50μl用于檢測檢測分析。

       樣本稀釋倍數:20

2、奶粉、奶油、奶酪

1、稱取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的樣品稀釋液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

4、取50ul下層溶液進行檢測分析。

     樣本稀釋倍數:1

【備注】

       如根據樣品的國家允許量標準判定（詳見附件表），在樣品測定前，用樣品稀釋液將樣品提取液再進一步進行適當倍數稀釋，即為待測樣品液； 取50ul待測樣品液進行定量或限量測定。

【酶標**分析程序】

測定前應須知：

1、     使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、     使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、     在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、     在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

黃曲霉**B1試劑盒操作步驟：

1、   將所需試劑從冷藏環境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、   按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、   配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌

        液。

4、   編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、   加標準品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。37℃環境中反應30min。

6、   取出將孔內液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭

        刺破）。

7、   每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸

        水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、    顯色：每孔加入A液50μl，再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色15min。

9、   測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內讀完數據）測定吸

       光度值（OD值）。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與黃曲霉**B1的含量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.025ppb為1.350；0.05ppb為1.030；0.1ppb為0.660； 0.2ppb為0.379；0.4ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是0.2ppb-0.4ppb； 樣本2的濃度范圍是0.05 ppb-0.1 ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉**B1的實際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉**B1標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉**B1實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準曲線：

B/B0 (%)

0.025     0.05     0.1      0.2      0.4

黃曲霉**B1(ppb) [μg/kg]

圖1：黃曲霉**B1檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV

      0    0.025   0.05   0.1    0.2    0.4

黃曲霉**B1 (ppb) [μg/kg]

圖2：黃曲霉**B1檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出黃曲霉**B1檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應黃曲霉**B1濃??作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】

1、     使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、     在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、     混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、     反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、     不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、     不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、     顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、     該試劑盒*佳反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

【儲存】

 原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

 有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。

【備注】

      如根據樣品的國家允許量標準判定（詳見附件表）；在樣品測定前，用樣品稀釋液將樣品提取液再進一步進行適當倍數稀釋，即為待測樣品液； 取50ul待測樣品液進行定量或限量測定。

 附件表：黃曲霉**B1國家允許量標準    

（說明：色拉油衛生標準GB13103-91 和精練食用植物油衛生標準GB15197被GB2716－2005覆蓋取代。） 

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