對蝦皮下和造血器官壞死病毒（HHNV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）PCR反應程序
1．常規(guī)程序
將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。*后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。
平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底。
5．PCR反應液的配制
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在*后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時，有時會擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。
按照常規(guī)的方法配制反應體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，*后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。
標準的對蝦皮下和造血器官壞死病毒（HHNV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物
各200umol/L
引物
各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應五要素
參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：
引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，
就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度：
以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶
核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是*末及倒數(shù)**個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，
被擴增的靶序列*好有適宜的酶切位點，
這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：
每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，
一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，對蝦皮下和造血器官壞死病毒（HHNV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：
溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；
蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。
對蝦皮下和造血器官壞死病毒（HHNV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時間的設置：
基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，
除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的*主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇*適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi)，
選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，
提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
對蝦皮下和造血器官壞死病毒（HHNV）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠
的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。
單純性皰疹1型（HHV1）qPCR檢測試劑盒 Herpes simplex type 1 (HHV1)
單純性皰疹1&2型（HHV1&2）qPCR檢測試劑盒 Herpes simplex type 1 and 2 (HHV1&2)
單純性皰疹2型（HHV2）qPCR檢測試劑盒 Herpes simplex type 2 (HHV2)
人類皰疹病毒3 qPCR檢測試劑盒 Human Herpesvirus 3
人類皰疹病毒7 qPCR檢測試劑盒 Human Herpesvirus 7
人類皰疹病毒8 qPCR檢測試劑盒 Human Herpesvirus 8
甲型肝炎病毒qPCR檢測試劑盒 Hepatitis A Virus (HAV)
乙型肝炎病毒qPCR檢測試劑盒 Hepatitis B Virus (HBV)
丙型肝炎病毒qPCR檢測試劑盒 Hepatitis C Virus (HCV)
定型肝炎病毒qPCR檢測試劑盒 Hepatitis Delta Virus (HDV)
戊型肝炎病毒qPCR檢測試劑盒 Hepatitis E Virus (HEV)
人**瘤病毒6 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 6
人**瘤病毒11 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 11
人**瘤病毒58 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 58
人**瘤病毒16 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 16
人**瘤病毒18 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 18
人**瘤病毒33 qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 33
人**瘤病毒52&52b qPCR檢測試劑盒 Human Papillomavirus 52 and 52b
嗜水氣單胞菌qPCR檢測試劑盒 Aeromonas hydrophila
十二指腸鉤口線蟲qPCR檢測試劑盒 Ancylostoma duodenale
長雙歧桿菌qPCR檢測試劑盒 Bifidobacterium longum
蠟狀芽孢桿菌E33 qPCR檢測試劑盒 Bacillus cereus E33
擬桿菌屬qPCR檢測試劑盒 Bacteroides species
阿米巴qPCR檢測試劑盒 Balamuthia mandrillaris
兩歧雙歧桿菌qPCR檢測試劑盒 Bifidobacterium bifidum
酵母菌屬qPCR檢測試劑盒 Blastocystis genus
結(jié)腸彎曲菌qPCR檢測試劑盒 Campylobacter Coli
空腸彎曲桿菌qPCR檢測試劑盒 Campylobacter Jejuni
白色***qPCR檢測試劑盒 Candida albicans
產(chǎn)氣莢膜桿菌種屬qPCR檢測試劑盒 Clostridium perfringens species
產(chǎn)氣莢膜桿菌A& B型qPCR檢測試劑盒 Clostridium perfringens types A & B
隱孢子蟲屬qPCR檢測試劑盒 Cryptosporidium
環(huán)孢子蟲qPCR檢測試劑盒 Cyclospora cayetanensis
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