25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒

使用說明書

預期應用

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中25羥基維生素D3(25-HVD3)含量。

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒基本原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗25羥基維生素D3(25-HVD3)抗體包被于酶標板上，實驗時樣品或標準品中的25羥基維生素D3(25-HVD3)與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗25羥基維生素D3(25-HVD3)抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗25羥基維生素D3(25-HVD3)抗體與結合在包被抗體上的25羥基維生素D3(25-HVD3)結合、生物素與親和素特異性結合而形成**復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，25羥基維生素D3(25-HVD3)濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中25羥基維生素D3(25-HVD3)的濃度。

描述:

組成：

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒檢測前準備工作:

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為200ng/mL）。然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據實際用量來稀釋，如200μL/管）

1.使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。

2.標準品(凍干品)：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200ng/mL。準備7個稀釋標準品的EP管，每個EP管中加入500μL的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋，標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

1. 在各孔中加入標準品或樣品各100μL， 37℃孵育90分鐘

2. 加入100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘

3. 洗滌3次

4. 加入100μL酶結合物工作液， 37℃孵育30分鐘

5. 洗滌5次

6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分鐘左右

7. 加入50μL終止液，立即在450nm波長處測量OD值

8. 結果計算

一、操作因素對ELISA結果的影響ELISA操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。

1.加樣

2.溫育

3.洗滌

4.顯色

5.比色

二、灰區的設置通常情況下，ELISA定性實驗以“陽性”和“陰性”來報告結果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性**測定結果報告的依據。

三、標本復查ELISA手工檢測過程復雜，影響因素較多，即使室內質控在控，也可能因孔間差異而造成結果的差異，因此加大復查力度是保證結果準確性的可靠方法，比如對HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項目的可疑、弱陽性標本及少見模式的檢測結果進行復查。

四、結果判斷和報告常用下列幾種方法表示結果：

1.定性測定

2.半定量測定 結果一般以滴度表示。

3.定量測定 即用已知量的標準品作一系列稀釋后進行ELISA測定，繪制標準曲線，結果以**量或單位表示。在ELISA定量檢測中每一塊反應板都必須繪制相應的標準曲線。

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒會出現的問題及解決辦法：

1. 加入反應終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶標記物。

解決辦法：請按照操作步驟進行。

b.原因：試劑盒內容物未能充分回。

解決辦法：確定試劑盒內容物回溫后再進行操作。

c.原因：室溫太低。

解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請于操作步驟4，適當延長溫育時間。

d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。

解決辦法： 請用試劑盒內所提供的清洗液清洗。

e.原因：試劑盒已過有效期限。

解決辦法：請更換成仍在有效期限內的試劑盒。

2. 標準曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。

解決辦法： 請確認溫育位置既不透光也不透風(如抽屜內)。

b.原因：操作時間拖太久。

解決辦法：請在方法熟練后再進行操作。

c.原因：微孔間相互污染。

解決辦法： 加樣品時，請小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標準品或酶標記物所加入的量不一致。

解決辦法：請使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。

解決辦法：加樣品或試劑時，吸頭請勿接觸微孔。

f.原因：洗板過程發生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進行下一步驟)。

解決辦法：請隨時監控洗板機洗板過程，洗完后立即進行下一步驟。

3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。

a.原因：室溫太高(>25℃)。

解決辦法： 若無法降低室內溫度，請適當縮短步驟4的溫育時間。

b.原因：底物溶液受到污染。

解決辦法： 若發現底物溶液已呈現淡藍色，請不要再使用。

c.原因：反應時間超過太久。

解決辦法：請控制反應時間。

d.原因：酶標記物污染了盒內其它試劑。

解決辦法：使用過的吸頭應立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標記物與底物溶液)接觸過的容器應立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)

4. 陰性標準品的吸光值低于陽性標準品的吸光值。

a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。

解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。

b.原因：洗板過程發生問題(同2-f.)。

解決辦法：請參考2-f.

c.原因：添加樣品或酶標記物的量不一致。

解決辦法： 請參考2-d.

注意事項：

A 仔細閱讀說明書。

B 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。

C 按說明書確定所有試劑齊全（數量、體積）。

D 標本制備要規范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存。

E 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）。

F 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據檢測標本數量確定所需試劑的量。

G 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。

H 檢查不穩定或者變質的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。

I 保證充分的孵育時間和溫度。

J 切勿使用不同生產批號的試劑取代現有試劑或混合現有試劑。

K 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產生。

L 在實驗開始之前，安排好實驗流程。

M 在實驗開始之前，清潔工作臺。

N 若有問題，應與我公司或代理商的技術支持聯系

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2. 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

 特異性：

本試劑盒用于檢測25羥基維生素D3(25-HVD3)，經檢測與其它相似物質無明顯交叉反應。

由于受到技術及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關或相似物質交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經檢測的其它物質有交叉反應。

回收率：

分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的5羥基維生素D3(25-HVD3)（加標樣品），重復測定并計算其均值，回收率為測定值與理論值的比率。

線性：

在定值血清及血漿樣本內加入適量的25羥基維生素D3(25-HVD3)，并倍比稀釋成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待測樣本，線性范圍即為稀釋后樣本中小鼠25羥基維生素D3(25-HVD3)含量的測定值與理論值的比率。

25羥基維生素D3(25-HVD3)酶聯**吸附檢測試劑盒精密度：
精密度用樣品測定值的變異系數 CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

批內差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續測定 20 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。

批間差：選取 3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復

測定 8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。

批內差： CV<10%

批間差： CV<12%

穩定性：

經測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。

為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。

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