豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒

使用說明書

預(yù)期應(yīng)用

本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定兔血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF含量。

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒基本原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF抗體與結(jié)合在包被抗體上的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成**復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF的濃度。

描述:

組成：

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:

1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為1000pg/mL）。然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5mL10ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5mL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。 

4. 生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當(dāng)日使用。

5. 酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。

當(dāng)日使用。

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據(jù)實(shí)際用量來稀釋，如200μL/管）

1.使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。

2.標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1000pg/mL。準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入500μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1. 在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100μL， 37℃孵育90分鐘

2. 加入100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘

3. 洗滌3次

4. 加入100μL酶結(jié)合物工作液， 37℃孵育30分鐘

5. 洗滌5次

6. 加入90μL底物溶液， 37℃孵育15分鐘左右

7. 加入50μL終止液，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值

8. 結(jié)果計(jì)算

一、操作因素對(duì)ELISA結(jié)果的影響ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。

1.加樣

2.溫育

3.洗滌

4.顯色

5.比色

二、灰區(qū)的設(shè)置通常情況下，ELISA定性實(shí)驗(yàn)以“陽(yáng)性”和“陰性”來報(bào)告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽(yáng)性判斷值”（cut-off value，CO值），這是定性**測(cè)定結(jié)果報(bào)告的依據(jù)。

三、標(biāo)本復(fù)查ELISA手工檢測(cè)過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法，比如對(duì)HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等項(xiàng)目的可疑、弱陽(yáng)性標(biāo)本及少見模式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。

四、結(jié)果判斷和報(bào)告常用下列幾種方法表示結(jié)果：

1.定性測(cè)定

2.半定量測(cè)定 結(jié)果一般以滴度表示。

3.定量測(cè)定 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以**量或單位表示。在ELISA定量檢測(cè)中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒會(huì)出現(xiàn)的問題及解決辦法：

1. 加入反應(yīng)終止液后，沒有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶標(biāo)記物。

解決辦法：請(qǐng)按照操作步驟進(jìn)行。

b.原因：試劑盒內(nèi)容物未能充分回。

解決辦法：確定試劑盒內(nèi)容物回溫后再進(jìn)行操作。

c.原因：室溫太低。

解決辦法：若室溫太低(<19℃)，請(qǐng)于操作步驟4，適當(dāng)延長(zhǎng)溫育時(shí)間。

d.原因：未使用試劑盒的清洗液清洗。

解決辦法： 請(qǐng)用試劑盒內(nèi)所提供的清洗液清洗。

e.原因：試劑盒已過有效期限。

解決辦法：請(qǐng)更換成仍在有效期限內(nèi)的試劑盒。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。

解決辦法： 請(qǐng)確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。

b.原因：操作時(shí)間拖太久。

解決辦法：請(qǐng)?jiān)诜椒ㄊ炀毢笤龠M(jìn)行操作。

c.原因：微孔間相互污染。

解決辦法： 加樣品時(shí)，請(qǐng)小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。

解決辦法：請(qǐng)使用已校正過的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。

解決辦法：加樣品或試劑時(shí)，吸頭請(qǐng)勿接觸微孔。

f.原因：洗板過程發(fā)生問題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。

解決辦法：請(qǐng)隨時(shí)監(jiān)控洗板機(jī)洗板過程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。

3. 吸光值均偏高(或線性不夠陡)。

a.原因：室溫太高(>25℃)。

解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請(qǐng)適當(dāng)縮短步驟4的溫育時(shí)間。

b.原因：底物溶液受到污染。

解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請(qǐng)不要再使用。

c.原因：反應(yīng)時(shí)間超過太久。

解決辦法：請(qǐng)控制反應(yīng)時(shí)間。

d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。

解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)

4. 陰性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值低于陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。

a.原因：微孔中的試劑未能充分混合。

解決辦法： 試劑加完后，需輕敲盤四周使其充分混合均勻。

b.原因：洗板過程發(fā)生問題(同2-f.)。

解決辦法：請(qǐng)參考2-f.

c.原因：添加樣品或酶標(biāo)記物的量不一致。

解決辦法： 請(qǐng)參考2-d.

注意事項(xiàng)：

A 仔細(xì)閱讀說明書。

B 檢查試劑盒標(biāo)簽上的有效期。如果超過有效期，請(qǐng)勿使用。

C 按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）。

D 標(biāo)本制備要規(guī)范，每份標(biāo)本體積要按2-3個(gè)復(fù)孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內(nèi)無法實(shí)驗(yàn)者，注意低溫保存。

E 準(zhǔn)備好所有實(shí)驗(yàn)額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標(biāo)儀）。

F 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量。

G 檢查試劑盒內(nèi)每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內(nèi)說明書推薦的條件存儲(chǔ)。

H 檢查不穩(wěn)定或者變質(zhì)的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或者檢測(cè)稀釋液，可能在設(shè)計(jì)時(shí)就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標(biāo)板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標(biāo)板之前，必需不停攪拌。

I 保證充分的孵育時(shí)間和溫度。

J 切勿使用不同生產(chǎn)批號(hào)的試劑取代現(xiàn)有試劑或混合現(xiàn)有試劑。

K 在混合或溶解蛋白溶液時(shí)，避免泡沫產(chǎn)生。

L 在實(shí)驗(yàn)開始之前，安排好實(shí)驗(yàn)流程。

M 在實(shí)驗(yàn)開始之前，清潔工作臺(tái)。

N 若有問題，應(yīng)與我公司或代理商的技術(shù)支持聯(lián)系

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒結(jié)果判斷:

1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

 特異性：

本試劑盒用于檢測(cè)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF，經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。

由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對(duì)所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè)，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

回收率：

分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF（加標(biāo)樣品），重復(fù)測(cè)定并計(jì)算其均值，回收率為測(cè)定值與理論值的比率。

線性：

在定值血清及血漿樣本內(nèi)加入適量的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF，并倍比稀釋成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待測(cè)樣本，線性范圍即為稀釋后樣本中小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF含量的測(cè)定值與理論值的比率。

豬血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF酶聯(lián)**吸附檢測(cè)試劑盒精密度：
精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù) CV 表示。CV(%) = SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè),每份樣本連續(xù)測(cè)定 20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。

批間差：選取 3 個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)

測(cè)定 8 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。

批內(nèi)差： CV<10%

批間差： CV<12%

穩(wěn)定性：

經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。

為減小外部因素對(duì)試劑盒破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。

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