操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產品特點：

1、公司產品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產品組成:

使用方法:

一:培養細胞預處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養細胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細胞預處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現沉淀漂浮是正常現象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發。

13. 重復上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產品：
組織PKA激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次苯甲酰三氟丙酮

細胞Src激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次仲辛醇

組織Src激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次安息香

細胞PKC激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次苯酞

組織PKC激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次甲基正壬酮

細胞AMPK激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次脫水穿心蓮內酯

組織AMPK激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次香附

細胞B-RAF激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次厚樸

組織B-RAF激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次隔山消

細胞C-TAK激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次大果木姜子

組織C-TAK激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次艾葉

細胞CaM KII激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次盾葉薯蕷

組織CaM KII激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次巴龍霉素

細胞CaM KIV激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次氟尿嘧啶

組織CaM KIV激酶活性定量檢測試劑盒（A/B/C）20次雙
豬瘟病毒/口蹄疫病毒通用型（CSFV/FMDV-U）檢測試劑盒(雙重熒光-PCR法)PROG ELISA kit  大鼠孕/孕酮偏釩酸銨 99.99% (metals basis)

E ELISA Kit  大鼠雌偏釩酸銨 ACS

VCAM-1/CD106 ELISA kit   大鼠血管內皮粘附分子偏釩酸銨 99.999% (metals basis)

IL-8/CXCL8 ELISA Kit  大鼠白介素8偏釩酸銨 99.9%metals basis

ADP ELISA Kit  大鼠脂聯素硫酸鋁，十八水 99.95% metals basis

f- BetaCG ELISA Kit  大鼠游離β絨毛膜促性腺乙酸銨 AR

ALD ELISA Kit  大鼠固酮乙酸銨 CP

NA ELISA Kit  大鼠去甲腎上腺素乙酸銨 GR，≥99.0%

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