操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產品特點：

1、公司產品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產品組成:

使用方法:

一:培養細胞預處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養細胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細胞預處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現沉淀漂浮是正?，F象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發。

13. 重復上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產品：
human herpesviruses RFLP基因分析試劑盒20次胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎（TSSB）大鼠游離狀腺原氨酸（Free-T3）ELISA試劑盒,

C. albicans RFLP基因分析試劑盒20次酪蛋白瓊脂倉鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL）ELISA試劑盒,

C. glabrata RFLP基因分析試劑盒20次產芽孢肉湯豚鼠表皮生長因子（EGF）ELISA試劑盒,

C. tropicalis RFLP基因分析試劑盒20次乳酸桿菌瓊脂培養基高敏狀腺原氨酸（u-T3）ELISA試劑盒--動物，人

C. krusei RFLP基因分析試劑盒20次乳酸桿菌肉湯培養基氯化鎂孔雀綠肉湯（MM，RV Medium）

C. guilliermondii RFLP基因分析試劑盒20次維生素B12測定用培養基L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽

C. parapsilosis RFLP基因分析試劑盒20次煙酸測定用培養基蟾他靈 Bufotaline

Cr. Neoformans RFLP基因分析試劑盒20次葉酸測定培養基FMOC-D-絲氨酸

A. fumigatus RFLP基因分析試劑盒20次泛酸測定培養基抗蛋白酶

F. solani RFLP基因分析試劑盒20次游離生物素測定培養基卡那霉素硫酸鹽

Helicobacter pylori RFLP基因分析試劑盒20次肌測定培養基鳥嘌呤鹽酸鹽

M. tuberculosis RFLP基因分析試劑盒20次多價蛋白胨酵母膏（PY）培養基轉移核糖核酸（酵母）

M. marinum RFLP基因分析試劑盒20次營養肉湯（不含糖）核糖核酸鈉鹽（酵母）

M. scrofulaceum RFLP基因分析試劑盒20次亮綠乳糖培養基（BGL）透析袋6000

M. avium RFLP基因分析試劑盒20次腸道菌增菌肉湯(EE)96孔單條可拆酶標板
霍亂弧菌O1(VC O1)檢測試劑盒(熒光-PCR法)TPHuman thymidinephosphorylase) ELISA Kit  人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶水質鈦標樣 分析標準品

PARP(Human Poly ADP ribose polymerase) ELISA Kit  人多聚ADP核糖聚合酶鈦 99.8%，60nm,松裝密度0.54g/cm3,黑色

GCK(Human glucokinase) ELISA Kit  人葡萄糖激酶5-甲基煙酸 97%

MAO(Human monoamine oxidase) ELISA Kit  人單氧化酶化  GR,≥99.5%(AT)

cPLA2(Human cytosolic phospholipase A2) ELISA Kit  人胞漿型磷脂酶A2化鈉 CP,99.0%

DAO(Human diamine oxidase) ELISA Kit  人二氧化酶三 AR,99.0%

COX-2(Human cyclooxygenase-2) ELISA Kit  人環加氧酶2三 CP,98.5%

CDK5(Human Cyclin Dependent Kinase 5) ELISA Kit  人周期素依賴性激酶5三 standard for GC,>99.8%(GC)

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