為確保ELISA實驗中各步驟的準確性，需從操作規范、樣本與試劑管理、質控與驗證三方面進行系統優化。以下是具體措施：

一、優化操作規范

1、?加樣與溫育?

使用校準后的移液器，避免氣泡或交叉污染；嚴格遵循說明書控制溫育時間（如37℃±0.5℃）。

封板需嚴密，防止陽性樣本蒸發導致“花板”現象。

2、?洗滌與顯色?

洗滌需徹底（建議5-6次，每次靜置30秒），以降低背景噪音。

顯色劑（如TMB）需臨用前配制，避光操作，顯色時間不宜過長。

二、樣本與試劑管理

1、?樣本質量控制?

避免溶血、**污染及反復凍融；血清樣本中類風濕因子（RF）可通過熱滅活（56℃ 30分鐘）處理。

樣本稀釋時，稀釋劑應含BSA以減少非特異性吸附。

2、?試劑選擇與保存?

選擇高特異性抗體對，標準品需參考國際或國家標準品。

試劑避免反復凍融，分裝保存以維持活性；使用前需平衡至室溫。

三、質控與驗證措施

1、?質控指標監測?

回收率應在80%-120%之間，稀釋線性偏差需在80%-120%內。

板內變異系數（CV）應<5%，板間CV<15%。

2、?對照設置?

包括陰性對照（空白孔、樣本陰性對照）和陽性對照（標準品或陽性樣本），驗證試劑活性。

3、?設備與環境控制?

定期校準酶標儀波長（如450nm）和移液器精度。

保持實驗室溫度、濕度穩定，避免污染物接觸酶標板。

四、常見問題處理

?高背景信號?：優化封閉條件（延長封閉時間）、調整抗體濃度、嚴格洗滌。

?信號缺失?：檢查試劑活性、孵育時間及溫度，避免樣本含抑制劑。

通過以上措施，可顯著提升ELISA實驗的準確性和重復性。