熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）是一種在DNA擴增過程中實時監測熒光信號變化的生物技術。它通過在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光標記探針，實時跟蹤PCR產物的**。熒光定量PCR的準確性可能會受到多種因素的影響，包括但不限于：

1、實驗設計

引物設計：引物必須與目標序列具有高度特異性，以避免非特異性擴增。設計不當的引物可能會導致錯誤的目標識別或形成引物二聚體，這都會降低檢測的準確性。

模板質量：模板DNA或RNA的純度和完整性對PCR效率至關重要。污染或者降解的模板可能導致擴增失敗或結果不可靠。

2、試劑與設備?

試劑盒靈敏度和特異性差異直接影響結果。?

儀器控溫精度（如邊緣效應）、CCD/PMT性能及校準狀態均會引入誤差?。

3、酶的種類與濃度

需要使用適量的Taq DNA聚合酶，濃度過高可能導致非特異性擴增，而過低則會減少產物量。

4、操作規范?：包括加樣精度、污染控制（如手套更換）及移液器清潔度，操作失誤易引發假陽性/陰性。?

5、?交叉污染?：實驗環境中殘留的DNA氣溶膠或試劑污染是假陽性的主要來源。

6、 反應條件

反應體系：包括酶、dNTPs、緩沖液、熒光染料或探針的選擇和配比。優化的反應體系有助于提高擴增效率和特異性。

PCR條件：如變性、退火和延伸的溫度及時間參數需要根據特定的實驗需求進行優化。

7、 質量控制措施

內參基因：使用內參基因進行數據標準化，可以減少由于樣品量變化帶來的變異，確保結果更加可靠。

陰陽性對照：每次實驗都應該包含陽性對照和陰性對照，用于監控整個實驗過程中的污染情況和反應條件是否正常。

8、循環次數：過多的循環次數可能引入非特異性產物，影響結果的準確性。

9、dNTP的濃度：dNTP的濃度要平衡，過高會與Mg2+結合，降低游離Mg2+的濃度，影響酶活性。

10、擴增效率：擴增效率過低（<90%）或過高（>110%）可能表明引物設計不佳、標準品稀釋錯誤或存在抑制劑等問題。

綜上所述，為了確保熒光定量PCR實驗結果的準確性和可重復性，研究人員需要綜合考慮上述各個方面，并采取相應的質量控制措施。熒光定量PCR廣泛應用于醫學研究、分子生物學研究、臨床診斷、病原體檢測、基因表達分析等領域，是現代生物科學研究和應用中不可或缺的技術。?