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蛋白質鹽析與透析實驗步驟
1.透析袋的預處理
為防干裂,新透析袋出廠時常用10%甘油進行處理,并含少量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質,需除去。將透析袋剪成100~120mm的小段,用50%乙醇煮沸1h,再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌,后用蒸餾水沖洗3~5次(新透析袋如不作上述特殊處理,也可用沸水煮5~10min,再用蒸餾水洗凈即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或線繩扎緊,也可用特殊的透析袋夾夾緊,從另一端灌滿水,用手指稍加壓,檢查是否有滲漏,沒有滲漏后方可使用。處理好的透析袋保存于蒸餾水中待用。
2.蛋白質鹽析
取10%雞蛋清溶液5mL于試管中,加入等量飽和硫酸銨溶液,微微搖動試管,使溶液混合后靜置數分鐘,蛋清蛋白質即可析出。如無沉淀可再加少許飽和硫酸銨溶液,觀察蛋白質的析出。取少量沉淀的蛋白質,加水稀釋,觀察沉淀是否會再次溶解。
3.蛋白質的透析
注入含雞蛋清的氯化鈉蛋白質溶液5mL于透析袋中,將袋的開口端用線扎緊,并懸掛在盛有蒸餾水的燒杯中,開口端位于液面之上。10min后,自燒杯中取出1mL溶液于試管中,加1%硝酸銀溶液一滴,如有白色氯化銀沉淀**,則證明蒸餾水中有Cl-存在。再自燒杯中取出1mL溶液置于另一試管中,加入1mL10%氫氧化鈉溶液,然后滴加1~2滴1%硫酸銅溶液,觀察有無藍紫色出現。每隔20min更換蒸餾水一次,數小時后可觀察到透析袋內出現輕微混濁,此為蛋白質沉淀。繼續透析至蒸餾水中不再**氯化銀沉淀為止。實驗記錄透析完成所需的時間。
注意事項:
蛋白質溶液用透析除鹽時,正負離子透過半透膜的速度不相同,如(NH4)2SO4中的?透析速度快,而透析過程中膜內的?會**H2SO4,使膜內蛋白質溶液呈酸性。因此,為避免蛋白質變性,用鹽析法純化蛋白質時,開始時應用0.1mol/L的NH4OH透析。此外,為了保證蛋白質在透析過程中不發生變性,可以將透析過程置于低溫下進行。
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