PCR反應primers design這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：

1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產量；

2)GC%，40%~60%；

3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性；

4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。

5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；

6)避免3'端的錯配；

7)避免內部形成二級結構；

8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；

9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；

10)學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。