一、結(jié)合物的制備

1. 戊二醛交聯(lián)法

戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。

ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

2. 過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP*可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結(jié)果不易重演。

按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中*后的酶活性測定，因經(jīng)過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響*終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法*為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得*佳的分離效果，但費用較貴。

結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。*適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，并獲得測定的*佳靈敏度，達到*合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的*高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的*適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的*大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。

二、結(jié)合物的保存

酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液。現(xiàn)在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止生長。

三、結(jié)合物的稀釋液

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。