**分子生物技術(shù)
簡介：
人體內(nèi)的細胞遇抗原時, 會受刺激繁殖, 而產(chǎn)生大量有專一性的抗體(monoclonal antibody). 而抗元常引起不同的B細胞產(chǎn)生抗體, 故在血液中的抗體實際上是多元性抗體(polyclonal antibodies), 其原因是此抗元常含有不只一處致抗體的部位(epitopes), 每個部位都可引起一個不同B細胞抗體.
抗體有五種, IgG, IgA, IgD, IgE及IgM, 對同一個人而言, 此5種抗體均對同一抗元有作用. 抗體的形狀如Y字形, 有二條輕鍊, 二條重鍊. 輕鍊又有K和λ二種, (但同一抗體只含其一), 但重鍊則只有一種. 即IgG是γ, IgA是α, IgD是δ, IgM是μ, IgE是ε.
不論輕, 重鍊均含有變異端(variable region)與恆常端(constant region), 與抗元作用的部分是在輕, 重鍊變異端的高度變異(hypervariable region)部分, 大約站15Å×20Å×15Å的空間大小.
抗體之所以能有如此多變化, 并非人的基因有如此大量, 而是在B細胞成熟過程中, 其基因重組(有很多恆常端, 變異端, 連接端, 變化diversity端的基因, 可以重組排列), 可以構(gòu)成不同的抗體.
將酶銜接至抗體之技術(shù)
將酶銜接至抗體上, 是使酶(例如horweradish peroxidase HRPO, 或alkaline phosphatase)與抗體形成穩(wěn)定的. 且不影響酶與抗體之功能.
以HRPO銜接為例, 其化學變化如下：
此一技術(shù), 可用于Enzyme-linked immounoworbent assay (ELISA)及western boltting, 其方法如下：
材 料：
1mg/ml antibody solution
0.1M phosphate buffer, pH6.8
Horseradish peroxidase (HRPO)
0.1M Carbonate buffer, pH9.2
Sodium periodate (NaIO4) solution, freshly prepared
Sodium borohydride (NaBH4) solution, freshly prepared
Saturated ammonium sulfate (NH4)2SO4 solution
Tris/EDTA/NaCl (TEN) buffer, pH7.2
BSA
Glycerol
Dialysis membrane
Pasteur pipet fitted with glass wool
Sephadex G-25, medium
方 法：
1. 將1mg/ml抗體以2公升0.1M phosphate buffer pH6.8透析, 過夜, 4℃ 緩緩攪拌. (抗體量可以A280/1.44＝mg Ig/ml來計算) (透析膜影 50﹪ethanol浸一小時, 再以10mM NaHCO3浸一小時, 再以1mM EDTA浸一小時, 再以dH2O沖洗, 再保存在phosphaed buffer中, 4℃, 為防**生長, buffer中可加入0.01﹪的sodium azide).
2. 溶10mg的GRPO于1ml的0.1M carbonate buffer, pH9.2中.
3. 將0.25ml新配好的NaIO4液與0.25ml的10mg/ml HRPO/carbonate液溷合, 蓋緊蓋子, 置室溫2hr(避免光照).
4. 在一支Pasteur pipette中放入適量glass wool, 將出口處以parafilm包好, 再將1ml以透析過的antibody液, 加入0.5ml的10mg/ml HRPO液中, 再將0.25g的Sephadex G-25加入此antebody/HRPO溷合液中 (此一步驟可增進酶與抗體之結(jié)合). 將此溷合物加入此Pasteur pipette中.
5. 置于暗室, 室溫3hr.
6. 將此Column以0.75ml的Carbonate buffer將conjugate洗出, 保存.
7. 在此釋出液中, 加入38μl的新配好之NaBH4液, 在室溫, 暗室, 置30min.
8. 再加入112μl的NaBH4液, 暗室, 置60min.
9. 再加入飽和0.9ml (NH4)2SO4液, 緩緩攪拌30min, 4℃, 離心15min, 10,000xg.
10.倒去上清, 將沉淀物溶于0.75ml的TEN中.
11.透析此液, 4℃, 2公升的TEN, 過夜, **天換過一次TEN液, 再透析4hr.
12.將透析膜內(nèi)物取出, 加入適量BSA, 使此液中*終BSA量為20mg BSA/ml.
13.加入等量之glycerol并保存在-20℃.
配方：
0.1M Carbonate buffer, pH9.2：
1.36g Sodium carbonate
7.35g Sodium bicarbonate
950ml H2O
以1M HCl或1M的NaOH調(diào)整pH至9.2再加dH2O使體積成為1公升.
0.1M phosphate buffer, pH6.8：
保存A溶液：0.2M：31.2g NaH2PO4于1公升的dH2O中
保存B溶液：0.2M：28.39g NaH2PO4于1公升的dH2O中
溷合51ml的A液與49ml的B液, 及100ml的dH2O成為使用溶液.
飽和ammonium sulfate (NH4)2SO4液：
將1.21g Tris base加入990ml dH2O中, 使成0.01M Tris液, 調(diào)整pH至7.0, 再加dH2O, 使總體積為1公升, 量767g的(NH4)2SO4加入此Tris液中,攪拌, 并加為熱, 使溶, 調(diào)整pH至7.0, 并保存在4℃, (NH4)2SO4的結(jié)晶會沉淀出來.
Sodium borohydride (NaBH4)液：
5mg NaBH4/ml dH2O, 必須用前才配
Sodium periodate (NaIO4)液：
1.71mg NaIO4/ml dH2O (用前才配)
Tris/EDTA/NaCl(TEN)液, pH7.2：
在930ml dH2O中加入：
0.06g Tris base
0.37g Na2 EDTA
8.77g NaCl
調(diào)整pH至7.2(以HCl滴定)
加dH2O使體積成為1公升
附注：
1. 使用此法, 約1ng/ml至10ng/ml的抗元可以偵測到.
2. 在使用時, 可將結(jié)果稀釋100至10,000倍. 是效果如何而定.
準備**抗元
材 料：
E.Coli(長于培養(yǎng)液中)
Cell resuspending buffer
Lysozyme solution
Tris/EDTA/NaCl(TEN) buffer
10﹪SDS
8M urea
方 法：
1. 將5ml的E.Coli液在桌面離心機離心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 將沉淀**溶于5ml resuspending buffer中, 充分溷合(Votex).
2. 吸出1ml**液入1.5ml的微量離心管中, 置冰上再加入0.2ml的lysozyme液, 待5min.
3. 離心3,000rpm, 5min, 保留上層, 將沉淀物以1.2ml TEN溶解之. (因為有些蛋白質(zhì)是不溶于水, 故二者均應(yīng)保留)
4. 在每一種樣本中各加入65μl的10﹪SDS, 置37℃, 10min, 此時樣本即可使用, 若不使用應(yīng)冷凍保存, 若有必要可以8M urea液(4.8g urea加入10ml液中), 處理蛋白質(zhì).
配方：
cell resuspending buffer (10mM HEPES)
2.38g HEPES
加dH2O或1 liter
附注：
1. 在**學實驗中, Enzyme-Linked Immunolorbent Assays(ELISA)是常用于偵測**或抗元的方法. 一般分為直接法, 即將抗元放入micro titer plate, 使附著在內(nèi)壁, 再以diluting buffer使未被附著處能不接受抗體附著, 接者加入已銜接酶的抗體, 再洗去多馀的抗體, 再加入酶的作用物, 使產(chǎn)生反應(yīng).
另一種為間接法, 即先將抗體放入micro titer plate中, 使與內(nèi)壁附著, 再以diluitng buffer處理, 使未被附著的壁不會接受抗元, 再加入抗原始與抗體作用, 再洗去多馀的抗體, 再加入已銜接酶的抗元, 再洗去多馀的, 再加入酶的作用物使產(chǎn)生反應(yīng).
直接法的缺點是想測的有專一性的抗元須與其他雜質(zhì)互爭附于內(nèi)壁, 以致有時量少, 而間接法則可選擇性的留下受測的抗元.
2. 至于抗體, 可以用抗元配合adjuvat一同注射入體中, 4週后再增強注射一次, 2週后再增強一次, 以后每次抽血前7天注射一次即可取得含此抗體的血液. 此血液經(jīng)離心, 保存血清, 再以ammonium sulfate沉淀抗體(約33﹪的濃度即可沉淀出IgG), 再離心, 保存沉淀物, 再透析去鹽, 即可得抗體
公安機關(guān)備案號：
