材料：乳鼠（1-3d）

試劑：DMEM/F12（gibco），F(xiàn)BS（四季青），0.125%混合酶（胰酶和膠原酶1），GIBCO血清

器材：高壓包1（眼科剪、鑷2套，200目濾網(wǎng)1個(gè)），高壓包2（消化用小錐形瓶及轉(zhuǎn)子和蓋子，9cm平皿1套，100ml燒杯2個(gè)），高壓包3（小紗布?jí)K，細(xì)胞計(jì)數(shù)板），離心管（nunc，15ml，無(wú)菌），吸管（一次性單包裝無(wú)菌，碧云天），酒精棉球，75%酒精1瓶，口罩，帽子，手套，mark筆，離心機(jī)，超凈臺(tái)，培養(yǎng)箱，磁力攪拌器（可控溫），水浴鍋，消化水浴杯（內(nèi)有300ml雙蒸水），臥式染色缸1套（取心用），自制小支架2個(gè)（墊平皿用）。
（值得注意的是我所用的裝培養(yǎng)基的瓶子都是藍(lán)色絲口瓶，這種瓶子瓶口大，相對(duì)來(lái)說(shuō)不容易污染。）

關(guān)鍵詞：多次消化，病從口入

步驟：

一、準(zhǔn)備
1.  帶口罩、帽子，洗手，入培養(yǎng)室
2.  酒精棉球擦拭超凈臺(tái)后，放高壓包123和離心管、吸管、酒精棉球缸于超凈臺(tái)內(nèi)；
3.  放75%酒精1臥式染色缸一套（打開蓋）、mark筆于超凈臺(tái)外，放消化水浴杯于磁力攪拌器上（開機(jī)，溫度37度，轉(zhuǎn)速小于100）在超凈臺(tái)外；
4.  放15%完全培養(yǎng)基和消化酶于水浴鍋內(nèi)（開機(jī)，溫度37度）
5.  開超凈臺(tái)和培養(yǎng)室紫外30min。

二、30min后
1.帶手套，洗凈滑石粉，烘干后入培養(yǎng)室，關(guān)紫外，開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)，酒精擦手。
2.取4度不完全培養(yǎng)基置于超凈臺(tái)上，取平皿分為兩個(gè)，每個(gè)里面各放一套器械，然后各加不完全培養(yǎng)基8ml，取100ml燒杯一個(gè)。將100ml燒杯和其中一個(gè)平皿放在超凈臺(tái)外的桌子上，100ml燒杯中倒入75%酒精。
3.拿鑷子夾乳鼠，在燒杯中浸泡5-10秒，然后置于殺鼠臺(tái)上（就是臥式染色缸的蓋子），剪刀撕開皮膚，開胸（注意不要損傷消化道），除心包，擠壓后取心，直接取心室肌，置于裝有4度不完全培養(yǎng)基的平皿中。以此類推，直至全部取完。
4.只將有心肌的平皿放回超凈臺(tái)，酒精擦手。
5.用第2套剪刀先略微剪一下，基本上把每個(gè)心臟剪成兩半，目的在于先跑跑血。然后，小心移入另一個(gè)平皿，簡(jiǎn)單沖洗后，留下少許液體，猛剪，直到您滿意為止。然后再用不完全培養(yǎng)基洗三遍。用吸管移植消化用錐形瓶。
6.加入消化酶10ml，水浴杯內(nèi)消化10-15min，**次棄上清；剩余組織中再次加入混合酶繼續(xù)磁力消化，靜置后將上清液移入含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基的離心管終止消化，4℃保存；剩余組織用同樣方法反復(fù)消化，直至消化完全。1 200 r/min離心10 min，棄上清，用培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于25 cm培養(yǎng)瓶
7. 37度、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，吸出細(xì)胞懸液離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1-5×106個(gè)/ml后接種于培養(yǎng)瓶和鋪有爬片的6孔板。
8. 24h后觀察，期間不要看細(xì)胞。24h即可見同步搏動(dòng)了。

三、收拾培養(yǎng)室，寫實(shí)驗(yàn)記錄。


(拜力生物 GIBCO血清  )